Copines蛋白質(zhì)大家族是一類Ca2 依靠不飽和脂肪酸融合蛋白質(zhì)，遍布普遍且演變傳統(tǒng)。該大家族組員結(jié)構(gòu)類型具備同樣特點(diǎn):N尾端有兩個(gè)與給定的Ca2 依靠不飽和脂肪酸融合C2結(jié)構(gòu)域高寬比差不多的C2結(jié)構(gòu)域;C尾端有1個(gè)與融合蛋白質(zhì)(integrin)胞外區(qū)的A結(jié)構(gòu)域具備開放閱讀框的A結(jié)構(gòu)域?，F(xiàn)階段在哺乳類動(dòng)物中已發(fā)覺8個(gè)該蛋白質(zhì)大家族組員，各自為Copine-1～Copine-8(遺傳基因名CPNE1～CPNE8)。

Copine-1蛋白質(zhì)是最早被發(fā)覺的。Yoo等根據(jù)小影響RNA(small interfering RNA,siRNA)敲低Copine-1基因表達(dá)可以控制人骨腫瘤體細(xì)胞的繁衍、侵蝕和轉(zhuǎn)移。研究發(fā)現(xiàn)，惡性腫瘤萎縮因素α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)能夠上漲內(nèi)源Copine-1蛋白質(zhì)的表述，且TNF-α數(shù)據(jù)信號(hào)傳遞方式對(duì)毒蕈堿刺激性的反映伴隨著Copine-1表述的提高而提高;Copine-1蛋白質(zhì)還能夠提高核因素κB抑止蛋白質(zhì)(inhibitor of nuclear factor kappa-B，ⅠκB)的TNF-α依賴感溶解。除此之外，Copine-1蛋白質(zhì)與p65相互影響可以清除核因素κB (nuclear factor kappa-B,NF-κB)的基因表達(dá)。Copine-6蛋白質(zhì)關(guān)鍵在神經(jīng)細(xì)胞中表述，研究表明，Copine-6蛋白質(zhì)在癲癇病腦部中的非常表述很有可能與難治性癲癇有主要聯(lián)絡(luò)。Copine-7蛋白質(zhì)是一種成神經(jīng)元細(xì)胞衍化因素，可以調(diào)整間充質(zhì)干細(xì)胞美容的成牙釉質(zhì)細(xì)胞增殖和正方向管控牙釉質(zhì)唾沫磷蛋白質(zhì)表述。Copine-8蛋白質(zhì)可能是一個(gè)抑止亞急性髓性敗血癥腫瘤細(xì)胞繁衍的因素。

Copine-3蛋白質(zhì)與Copine-1蛋白質(zhì)的氨基酸序列開放閱讀框達(dá)到63%，其在身體的腦、肺、心血管、腎臟功能機(jī)構(gòu)中都有表述。Caudell等發(fā)覺，內(nèi)源Copine-3蛋白質(zhì)和外源性表述的資產(chǎn)重組Copine-3蛋白質(zhì)均可使外源性髓鞘不飽和脂肪酸偏堿蛋白質(zhì)磷酸化，殊不知，Copine-3蛋白質(zhì)氨基酸序列中缺乏已經(jīng)知道的蛋白激酶催化反應(yīng)結(jié)構(gòu)域，這種科學(xué)研究提醒，Copine-3蛋白質(zhì)很有可能具備自身的蛋白激酶活力。研究發(fā)現(xiàn)，Copine-3蛋白質(zhì)的高表述與亞急性脊髓性敗血癥的欠佳愈后相關(guān)。Tan等研究發(fā)現(xiàn)，與身患漫性冠脈疾患的病患對(duì)比，亞急性心肌梗塞病人的血細(xì)胞中Copine-3蛋白質(zhì)的表述量更低，說明CPNE3遺傳基因的低表述是產(chǎn)生亞急性心梗的潛在性風(fēng)險(xiǎn)源?？偟膩碚f，Copine-3蛋白質(zhì)在人體細(xì)胞中普遍表述，但其在人體細(xì)胞中的作用尚不確立。

本科學(xué)研究運(yùn)用加強(qiáng)型翠綠色熒光蛋白(plasmid enhanced green fluorescent protein,p EGFP)-N1搭建資產(chǎn)重組真核表達(dá)載體，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染人胚腎鱗狀上皮細(xì)胞293T、肺癌體細(xì)胞H1299，瞬間表述Copine-3-EGFP融合蛋白，觀查并檢驗(yàn)Copine-3蛋白質(zhì)在人體細(xì)胞中的精準(zhǔn)定位，為進(jìn)一步科學(xué)研究其分子生物學(xué)作用給予基本。

原材料和方式

1．關(guān)鍵實(shí)驗(yàn)試劑和儀器設(shè)備

DMEM培養(yǎng)液、10%胎牛血清(FBS)、OptiMEMTMⅠ培養(yǎng)液購(gòu)自Gibco企業(yè);107IU/L青霉素鈉 10 g/L氨芐青霉素(法抗)、0.25%蛋白酶體細(xì)胞消化酶購(gòu)自索萊寶高新科技有限責(zé)任公司;LipofectamineTMLTX Reagent with PLUSTMReagent轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)試劑、Pro LongTM Gold Antifade Mountant with DAPI封片狀、Copine-3抗原(兔抗人Ig G,2.63 g/L)和羅丹明標(biāo)識(shí)的奶羊抗兔Ig G二抗(1.5 g/L)購(gòu)自Invitrogen企業(yè);DNA分子量規(guī)范、Prime STAR HS DNA Polymerase、XhoⅠ和Bam HⅠ約束性內(nèi)切酶及其High Fidelity Prime ScriptTMRT-PCR Kit購(gòu)自Ta KaRa企業(yè);總RNA獲取、質(zhì)粒提取、DNA提純檢測(cè)試劑盒及其T4連接酶購(gòu)自天根生化高新科技(北京市)有限責(zé)任公司;GAPDH抗原(兔抗人Ig G,1 g/L)、β-acting抗原(兔抗人Ig G,1 g/L)購(gòu)自Affinity企業(yè);Histone H1抗原(鼠抗人Ig G,200 mg/L,Santa企業(yè));HRP標(biāo)識(shí)的奶羊抗兔Ig G二抗(1 g/L)和HRP標(biāo)識(shí)的奶羊抗鼠Ig G二抗(1 g/L)購(gòu)自Bioworld企業(yè);細(xì)胞質(zhì)蛋白質(zhì)與細(xì)胞核蛋白質(zhì)抽提檢測(cè)試劑盒、超敏ECL電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海市碧云天生物技術(shù)性有限責(zé)任公司;PVDF膜(Bio-Rad公司);引物合成和DNA測(cè)序由英濰捷基上海市貿(mào)易有限責(zé)任公司進(jìn)行;GTVisionⅢ型免疫力組織化學(xué)診斷試劑盒購(gòu)自遺傳基因高新科技(上海市)股權(quán)有限責(zé)任公司，肺癌組織芯片(HLug A030PG03)購(gòu)自上海市芯超生物高新科技有限責(zé)任公司。

CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo企業(yè));中小型快速冷凍離心機(jī)(Eppendorf企業(yè));蛋白質(zhì)電泳儀(Bio-Rad公司);Western轉(zhuǎn)印紙儀(Hoefer企業(yè));瑩光倒置顯微鏡、激光器掃描儀共焦顯微鏡(Leica企業(yè))。

2. 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 體細(xì)胞總RNA的提煉及反轉(zhuǎn)錄:

人支氣管炎鱗狀上皮細(xì)胞(human bronchial epithelial cells,HBE)注射于6填料中，用含法抗和10?S的DMEM塑造至90%匯聚。體細(xì)胞經(jīng)0.25%蛋白酶消化吸收后，500 r/min離心式5 min搜集。按天根生化高新科技(北京市)有限責(zé)任公司總RNA獲取檢測(cè)試劑盒(DP419)使用說明實(shí)際操作開展體細(xì)胞總RNA的獲取。將提煉到的體細(xì)胞總RNA，按High Fidelity Primer ScriptTMRT-PCR Kit檢測(cè)試劑盒使用說明書實(shí)際操作，反轉(zhuǎn)錄得到c DNA。

2.2 人CPNE3遺傳基因的增加:

依據(jù)CPNE3遺傳基因開放閱讀框(精彩片段總長(zhǎng)1613 bp)，設(shè)計(jì)方案生成上游引物5’-A C G T C T C G A G A T G G C T G C C C A G T G T G T C A C AA-3’和中下游引物設(shè)計(jì)5’-A C G TGGATC C GC C TGC TTC TG T T G T T T C G T G G CT-3’，上、中下游引物設(shè)計(jì)各自添加XhoⅠ、Bam HⅠ酶切位點(diǎn)(下橫線為酶切位點(diǎn)編碼序列)。以c DNA為模板，PCR擴(kuò)增CPNE3遺傳基因開放閱讀框，反映情況為:94℃預(yù)轉(zhuǎn)性5 min,94℃轉(zhuǎn)性30 s,65℃淬火30 s,72℃拓寬2 min，循環(huán)系統(tǒng)30次，72℃拓寬10 min。經(jīng)1%瓊脂糖電泳電泳原理檢驗(yàn)PCR物質(zhì)，膠回收利用與目地精彩片段尺寸一致的DNA雜帶。

2.3 重組質(zhì)粒p EGFP-N1-CPNE3的搭建:

將p EGFP-N1質(zhì)粒和CPNE3遺傳基因PCR物質(zhì)，各自用XhoⅠ和Bam HⅠ，在37℃下酶切1 h，膠回收利用提純酶切物質(zhì)，并且用T4 DNA連接酶16℃聯(lián)接留宿。聯(lián)接物質(zhì)轉(zhuǎn)換E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，運(yùn)用卡那霉素抵抗性挑選呈陽性集落，并抽提質(zhì)粒開展雙酶切認(rèn)證。將挑選到的呈陽性集落送轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。將轉(zhuǎn)錄組測(cè)序恰當(dāng)?shù)某赎栃约渥⑸溆诤敲顾氐腖B培養(yǎng)基中留宿塑造，搜集菌體，按高純質(zhì)粒小提中測(cè)檢測(cè)試劑盒使用說明書實(shí)際操作獲取質(zhì)粒，用以事后細(xì)胞轉(zhuǎn)染。

2.4 資產(chǎn)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染體細(xì)胞:

293T和H1299體細(xì)胞基本塑造于含法抗和10?S的DMEM培養(yǎng)液，消化吸收并注射6填料。待細(xì)胞生長(zhǎng)至60%匯聚時(shí)，按LipofectamineLTX with PlusTMReagent轉(zhuǎn)染表明，開展p EGFP-N1質(zhì)粒和p EGFP-N1-CPNE3重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染。

2.5 細(xì)胞爬片:

293T和H1299體細(xì)胞基本塑造于含法抗和10?S的DMEM培養(yǎng)液，消化吸收并注射于掛有細(xì)胞爬片的24填料中。待細(xì)胞生長(zhǎng)至60%匯聚時(shí)，按LTX with PlusTMReagent轉(zhuǎn)染表明，開展p EGFP-N1-CPNE3重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染，對(duì)照實(shí)驗(yàn)為p EGFP-N1質(zhì)粒。

2.6 激光器掃描儀共焦檢驗(yàn):

在2.5中細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，吸除細(xì)胞培養(yǎng)液，用PBS清理2次，添加4%多聚甲醛固定不動(dòng)10 min,0.2%Triton-100透化10 min。10%羊血清蛋白室內(nèi)溫度封閉式1 h。GAPDH抗原用2%羊血清蛋白按1∶100稀釋液，滴邊加個(gè)爬片上，4℃孵育留宿。PBST浸洗爬片3次，每一次5 min。羅丹明標(biāo)識(shí)的瑩光二抗(1∶100)室內(nèi)溫度遮光孵育2 h,PBST浸洗3次。在蓋玻片上滴加含DAPI的封片狀，將爬片反扣在封片狀上，用中性化環(huán)氧樹脂在爬片四周進(jìn)行封固。挑選405nm激起光檢驗(yàn)DAPI,488 nm激起光檢驗(yàn)EGFP和Copine-3-EGFP融合蛋白，552 nm激起光檢驗(yàn)GAPDH。在激光器掃描儀共焦顯微鏡下觀查并線片。

2.7亞體細(xì)胞組分離出來:

在2.4中細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，用PBS清理2次，0.25%蛋白酶消化吸收并離心式搜集體細(xì)胞。應(yīng)用上海市碧云天生物技術(shù)性有限責(zé)任公司的細(xì)胞質(zhì)蛋白質(zhì)與細(xì)胞核蛋白質(zhì)抽提檢測(cè)試劑盒，對(duì)體細(xì)胞亞組份開展分離出來。流程:向搜集的體細(xì)胞中添加200μl細(xì)胞核蛋白質(zhì)抽提實(shí)驗(yàn)試劑A，強(qiáng)烈渦流使體細(xì)胞徹底散掉，冰浴15 min。添加10μl抽提實(shí)驗(yàn)試劑B，渦流攪拌5 s，冰浴1 min，再度渦流5 s。4℃，12 000 r/min離心式15 min。將上清液遷移到新的EP管內(nèi)，獲得胞質(zhì)蛋白質(zhì)。向沉積中添加50μl細(xì)胞質(zhì)蛋白質(zhì)抽提實(shí)驗(yàn)試劑，渦流攪拌30 s，冰浴30 min，期內(nèi)每過1～2 min渦流攪拌30 s。4℃，12 000 r/min離心式15 min，遷移上清液到新的EP管內(nèi)，獲得細(xì)胞質(zhì)蛋白質(zhì)。Bradford測(cè)定方法蛋白質(zhì)濃度值，用以事后Western blotting檢驗(yàn)。

2.8 Western blotting檢驗(yàn):

各自取40μg胞質(zhì)蛋白質(zhì)和細(xì)胞質(zhì)蛋白質(zhì)經(jīng)10%SDS-PAGE凝膠電泳分離出來，100 V恒流源濕轉(zhuǎn)1 h至0.2μm PVDF膜上，5%低脂牛奶室內(nèi)溫度封閉式2 h,PBST(含0.5%司盤20的PBS溶液)洗膜3次。添加Copine-3抗原(1∶1000),4℃孵育留宿，PBST洗膜3次，每一次8 min。添加HRP標(biāo)識(shí)的羊抗兔Ig G二抗(1∶3000)，室內(nèi)溫度孵育1.5 h,PBST洗膜3次，每一次8 min。向PVDF膜上勻稱滴入ECL發(fā)亮液，于暗室內(nèi)顯影液。