酶魅力對(duì)AFs溶解率的危害:將酶魅力各自為1、2、3、4U和5U的漆酶各自與10μL0.1mg/mL的AFB1標(biāo)液渦流震蕩攪拌，30℃、200r/min孵育12h。對(duì)照實(shí)驗(yàn)為添加同樣大小的pH5.7的0.1mol/L的PBS₁別的情況同樣。全部試驗(yàn)反復(fù)3次，溶解率按式（1）測(cè)算:

（8）AFs的獲取

將孵育時(shí)間對(duì)AFs溶解率的危害:將酶魅力為3U的漆酶與10μL0.1mg/mL的AFB₁標(biāo)液渦流震蕩攪拌，放置30℃、200r/min各自孵育12、24、36、48h和60h。對(duì)照實(shí)驗(yàn)為添加同樣大小的pH5.7的0.1mol/L的硫酸銨緩存溶液（phosphatebuffersaline，PBS），別的情況同樣。孵育溫度對(duì)AFs溶解率的危害:將酶魅力為3U的漆酶與10μL0.1mg/mL的AFB₁標(biāo)液渦流震蕩攪拌，各自放置25、30、35、40℃和45℃氣溫下，200r/min孵育12h。對(duì)照實(shí)驗(yàn)為添加同樣大小的pH5.7的0.1mol/L的PBS，別的情況同樣。酶魅力對(duì)AFs溶解率的危害:將酶魅力各自為1、2、3、4U和5U的漆酶各自與10μL0.1mg/mL的AFB₁標(biāo)液渦流震蕩攪拌，30℃、200r/min孵育12h。對(duì)照實(shí)驗(yàn)為添加同樣大小的pH5.7的0.1mol/L的PBS₁別的情況同樣。解決的試品12000r/min離心式30s，使壁厚上的發(fā)酵物離心式至管底端，并轉(zhuǎn)換至10mL的具塞玻璃試管中，向玻璃試管中添加等大小的三氯甲烷（在陰涼處開展），渦流震蕩10min使其完全攪拌，隨后倒進(jìn)離心管架中，靜放30min分層次，取頂層液態(tài)于玻璃試管中，添加等容積三氯甲烷，汲取下一層有機(jī)相發(fā)酵液于離心管架中，同樣實(shí)際操作反復(fù)3次。合拼3次有機(jī)相于氮鍋爐吹管中，于45℃N2烘干。再用甲醇溶液融解出AFs，并且用0.22μm濾紙過慮。

（9）HPLC-MS/MS檢驗(yàn)AFs及標(biāo)曲的制作

配置的內(nèi)毒素標(biāo)液和提煉的內(nèi)毒素水溶液均用0.22μm濾紙過慮至高效液相瓶子中。

HPLC標(biāo)準(zhǔn):高效液相控制模塊為安捷倫1260Infinity:Inertsil0DS-3C18色譜柱（150mmX4.6mm，3μm）；流動(dòng)速度0.2mL/min；進(jìn)樣量5μL；流動(dòng)性相A為0.1%苯甲酸水溶液，流動(dòng)性相B為工業(yè)甲醇-水（3:7，V/V）；剖析時(shí)間30min；檢驗(yàn)溫度30℃。

MS/MS標(biāo)準(zhǔn):電噴霧器離子源:檢測(cè)方式:多反映檢測(cè)；離子源溫度300℃:錐孔工作電壓15psi；撞擊工作電壓135V；撞擊動(dòng)能30eV:毛細(xì)血管工作電壓4kV；品質(zhì)掃描儀范疇m/z313.0～285.0。

（10）響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單要素實(shí)驗(yàn)基本上，以孵育時(shí)間、孵育溫度和酶魅力做為調(diào)查要素，以AFB₁溶解率是響應(yīng)值，響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)要素與水準(zhǔn)如表1所顯示。

（11）AFB₁溶解物質(zhì)的測(cè)量及構(gòu)造分析

HPLC標(biāo)準(zhǔn):ZORBAX-SBC18色譜柱（100mmX2.1mm，3.5μm）。流動(dòng)性相A為0.1%苯甲酸水溶液，流動(dòng)性相B為0.1%苯甲酸–工業(yè)甲醇水溶液。梯度方向過柱程序流程:40%B，6min；60%B，保持16min；100%B，8min；一共運(yùn)作30min。進(jìn)樣量5μL，流動(dòng)速度0.4mL/min，柱溫箱30℃。

MS標(biāo)準(zhǔn):做霧化氣GS1工作壓力50psi；做霧化氣GS2工作壓力50psi；氣簾氣工作壓力35psi；離子源溫度550℃:離子源，工作電壓5500V；一級(jí)掃描儀去簇工作電壓100V；對(duì)焦工作電壓10V；品質(zhì)掃描儀范疇m/z100～1500；二級(jí)掃描儀選用TOFMS-Productlon-IDA方式收集質(zhì)譜分析數(shù)據(jù)信息，誘發(fā)撞擊解離能量分別為20、40V和60V，氣相前，用隔膜泵做品質(zhì)軸校準(zhǔn)，使品質(zhì)軸偏差低于0.002%。

二、結(jié)果與剖析

1、漆酶的同宗模建結(jié)果

在本試驗(yàn)常用漆酶分子結(jié)構(gòu)未被分析的情形下，運(yùn)用一些已經(jīng)知道漆酶分子結(jié)構(gòu)的根基上同宗模建能夠，較大的程度上獲得理想的目地蛋白質(zhì)三維構(gòu)造。運(yùn)用ChemBioDraw2014手機(jī)軟件及其MOEv2014.0901手機(jī)軟件制作并轉(zhuǎn)化成三維構(gòu)造，如圖所示1所顯示?？茖W(xué)研究AFs與該酶的融合方式第一步必須 搭建同宗實(shí)體模型，結(jié)果如表2和圖2所顯示。圖三分析表明，99%的漆酶殘基坐落于蛋白質(zhì)構(gòu)像的有效地區(qū)，這說明本試驗(yàn)搭建的漆酶同宗實(shí)體模型合乎立體化學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，具備合理化。

2、漆酶與AFB₁的相互影響剖析

選用分子對(duì)接方式科學(xué)研究AFB₁與栓菌漆酶表層的相互影響，致力于剖析AFB₁與漆酶相互影響方式。為確立漆酶和內(nèi)毒素的融合方式，選用誘發(fā)切合的對(duì)策，依據(jù)配位的構(gòu)像主鏈蛋白激酶袋子容許挪動(dòng)融入，將內(nèi)毒素各自對(duì)收到漆酶的活性位置，獲得漆酶魅力結(jié)構(gòu)域與配位的融合方式，如圖4所顯示，連接打分成-6.4532kca/mol。
 

依據(jù)所建立的連接實(shí)體模型，如圖4所顯示，AFB₁上叔丁基的氧分子可做為共價(jià)鍵的蛋白激酶，與漆酶上一個(gè)高寬比傳統(tǒng)與此同時(shí)也挨近碘離子（T1CuI）部位的His481上碳水化合物主鏈產(chǎn)生共價(jià)鍵，此外，AFB₁咪唑環(huán)上的氧分子還可以做為共價(jià)鍵的蛋白激酶，與漆酶Asn288的主鏈產(chǎn)生共價(jià)鍵，因而，His481和Asn288是漆酶和AFB₁融合時(shí)的重要碳水化合物結(jié)構(gòu)域，根據(jù)共價(jià)鍵相互影響。

酶-配位的融合感染力與其說相互影響的速率相關(guān)，遭受配位的結(jié)構(gòu)類型和歪曲水平及其配位和酶表層中間樣子相輔相成的危害。有研究表明共價(jià)鍵是酶與配位相互影響的重要相互作用力，參加共價(jià)鍵產(chǎn)生的氨基酸殘基被覺得是漆酶與小分子水配位相互影響的重要?dú)埢?。在其中氧分子與氨基酸殘基產(chǎn)生的氫鍵作用強(qiáng)過氧原子與氨基酸殘基產(chǎn)生的共價(jià)鍵，且共價(jià)鍵鍵長(zhǎng)越少，功效越強(qiáng)。連接仿真模擬研究表明，存有于T1銅孤電子對(duì)層中的單純的殘基His481最很有可能與AFs產(chǎn)生相互影響，產(chǎn)生共價(jià)鍵，推斷其能夠受體空氣氧化全過程中的電子轉(zhuǎn)移，提升 電子傳遞高效率，進(jìn)而提升 漆酶催化反應(yīng)工作能力。綜合性各個(gè)方面因素導(dǎo)致酶對(duì)內(nèi)毒素的功能工作能力存有差別，主要表現(xiàn)為連接成績(jī)不一樣。