2.3 資產(chǎn)重組菌全體細(xì)胞轉(zhuǎn)換制取GABA的技術(shù)提升

2.3.1 溫度對資產(chǎn)重組菌全體細(xì)胞轉(zhuǎn)換生產(chǎn)制造CABA的危害

酶法制取GABA是一個不可逆反應(yīng)，適合的氣溫能夠使GABA轉(zhuǎn)換率做到較大，因此利用設(shè)定不一樣的酶轉(zhuǎn)換溫度來研究溫度對GABA轉(zhuǎn)換率的危害。以100g/L的磷酸為底物，溶解雙蒸水中，添加濕菌體(在55℃恒溫水浴鍋預(yù)備處理50min，改進(jìn)細(xì)胞的滲透性)30U/g，在150r/min的水浴搖床中開展轉(zhuǎn)換，反映歷程中，操縱pH為5.0。溫度場設(shè)定為25、30、35、40、45、50℃，反映24h后停止反映并開展燒開解決，12000r/min離心式5min得上清液，適度稀釋液并過0.22μm有機(jī)濾膜完用HPLC-OPA柱前衍化法開展檢驗，結(jié)果見圖9。轉(zhuǎn)換率隨環(huán)境溫度上升慢慢提升 .當(dāng)轉(zhuǎn)換溫度做到40℃時，GAD-0和GAD-PL轉(zhuǎn)換率做到最大，各自為64.78％和82.27％，再次上升溫度，轉(zhuǎn)換率反倒減少。這是由于枯草枯草芽孢菌植物細(xì)胞厚，而反映溫度過低時，底物與胞內(nèi)酶液沒法充足觸碰促使轉(zhuǎn)換率低：當(dāng)反映溫度過高時，酶與PLP可靠性差，進(jìn)而危害GABA的轉(zhuǎn)換率。

2.3.2 DH對資產(chǎn)重組菌全體細(xì)胞轉(zhuǎn)換生產(chǎn)制造GABA的危害

以100g/L的磷酸為底物.溶解雙蒸水中，添加預(yù)備處理過的濕菌體30U/g，在40℃、150r/min的水浴搖床巾開展轉(zhuǎn)換，反映歷程中，每過2h用0.6mol/L的H₂S0₄或NaOH調(diào)整pH，使其一直與原始pH保持一致。pH梯度方向設(shè)定為3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0，反映24h后停止反映并開展燒開解決，12000r/min離心式5min得上清液，適度稀釋液并過0.22μm有機(jī)濾膜完用HPLC-OPA柱前衍化法開展檢驗。結(jié)果見圖10，當(dāng)pH為4.5或5.0時，GABA轉(zhuǎn)換率最大，GAD-0的GABA轉(zhuǎn)換率為75.45％和76.21％，GAD-PL的GABA轉(zhuǎn)換率為84.54％和84.21％。當(dāng)DH低于4.5時，底物-水谷氨酸鈉在弱酸性情況下非常容易酸水解反應(yīng)轉(zhuǎn)化成磷酸進(jìn)行析出，進(jìn)而產(chǎn)生奶白色混濁液態(tài).不利酶與底物的完全融合；當(dāng)pH超過5.0時不利酶促反應(yīng)巾心的磷酸氫鈣殘基以shifft-堿與PLP、底物融合，進(jìn)而抑止GABA的轉(zhuǎn)化成。由此可見，酶轉(zhuǎn)化法制取GABA的pH承受范疇窄，偏酸或過堿都不利酶促反應(yīng)開展，考慮到在高品質(zhì)濃度值底物下，過低的pH更非常容易造成 底物進(jìn)行析出，因此酶轉(zhuǎn)換適宜pH為5.0。

2.3.3 加菌量對資產(chǎn)重組菌全體細(xì)胞轉(zhuǎn)換生產(chǎn)制造GABA的危害

以100g/L的磷酸為底物，溶解雙蒸水中，添加預(yù)備處理過的不一樣濕菌體(20、30、40、50、60U/g)，在40℃、150r/min的水浴搖床中反映24h，反映歷程中，操縱pH為5.0。反映完成后開展燒開解決，12000r/min離心式5min得上清液，適度稀釋液后用碳水化合物柱前衍化法開展HPLC檢驗。結(jié)果見圖11，資產(chǎn)重組菌全體細(xì)胞轉(zhuǎn)換率伴隨著加菌量的提高而逐步提升，在其中GAD-PL和GAD-0分別在40U/g和50U/g時將底物徹底轉(zhuǎn)換，轉(zhuǎn)換率做到100％。GAD-PL的加菌量低于GAD-0是由于前面一種體細(xì)胞巾的PLP成分高過后面一種，PLP做為第二信使有益于酶促反應(yīng)的開展。
 

2.3.4 反應(yīng)速度對資產(chǎn)重組茵全體細(xì)胞轉(zhuǎn)換生嚴(yán)GABA的危害

以100g/L的磷酸為底物，溶解雙蒸水中，添加預(yù)備處理過的不一樣濕菌體，GAD-0和GAD-PL添加量分別為50U/g和40U/g，在40℃、150r/min的水浴搖床中反映24h，反映歷程中，操縱DH為5.0。反映完成后開展燒開解決，12000r/min離心式5min得上清液，適度稀釋液完用HPLC-OPA柱前衍化法開展檢驗，結(jié)果見圖12。在0～20h，GAD-0和GAD-PL轉(zhuǎn)換生成GABA的生產(chǎn)量隨時隨地問增加快速提升，在20h時轉(zhuǎn)換率做到100％，以后伴隨著反映開展，轉(zhuǎn)換率不會再產(chǎn)生變化。

2.3.5 底物濃度值對資產(chǎn)重組菌全體細(xì)胞轉(zhuǎn)換生嚴(yán)GABA的危害

以200g/L的磷酸為原始底物，溶解雙蒸水中，添加預(yù)備處理過的不一樣濕菌體，GAD-0和GAD-PL力口菌量分另0為50U/g和40U/g，在40℃、150r/min的水浴搖床中反映6h后，每過3h加補(bǔ)1.27g的磷酸共體至底物濃度值分別為200、250、300、350、400g/L，反映歷程中，操縱pH為5.0，反映48h。反映完成后開展燒開解決，12000r/min離心式5min得上清液，適度稀釋液并過0.22μm有機(jī)濾膜完用HPLC-OPA柱前衍化法開展檢驗。結(jié)果見圖13，當(dāng)?shù)孜餄舛戎底龅?00g/L磷酸時，GAD-0和GAD-PL轉(zhuǎn)換生產(chǎn)制造GABA的轉(zhuǎn)換率各自從100％(底物濃度值350g/L磷酸)降低為97.72％和98.43％。綜合性考慮到，為提升 工業(yè)制造高效率和節(jié)約中下游分離純化成本費，挑選350g/L做為酶法制取GABA的適宜底物濃度值。

3 總結(jié)

創(chuàng)作者取得成功搭建并資產(chǎn)重組表述了帶有Escherichiacoli來源于的gadB遺傳基因的資產(chǎn)重組菌B.subtilis/pHY300PLK-gadB。試驗說明在進(jìn)行發(fā)酵全過程中加上0.5mmol/L輔酶磷酸激酶PL的GAD總酶活做到28.14U/mL，是對比總酶活的1.72倍。進(jìn)一步提升資產(chǎn)重組菌全體細(xì)胞酶法生產(chǎn)制造GABA的技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果顯示，當(dāng)溫度為40℃，pH為5.0，GAD-0和GAD-PL的適宜加菌量各自為50U/g和40U/g時，GABA轉(zhuǎn)換率做到100％。當(dāng)磷酸濃度值為400g/L時，GABA生產(chǎn)量各自為275.60扎和273.61g/L?？偟膩碚f，創(chuàng)作者調(diào)查了菌體發(fā)醇塑造操作過程中加上輔酶磷酸激酶PL對資產(chǎn)重組菌產(chǎn)GAD及制取GABA的危害，開發(fā)設(shè)計了一種不用在進(jìn)行發(fā)酵全過程和酶轉(zhuǎn)換管理體系巾加上價格昂貴輔酶PLP就能高效率生產(chǎn)制造GABA的T藝技術(shù)性，為GABA在食品類和醫(yī)藥領(lǐng)域中的廣泛運用奠定了夯實基礎(chǔ)。