二、根據(jù)基因變異改進(jìn)

SOD的特性hCu/Zn-SOD做為抗氧化酶可以緩解活力自由基對(duì)體細(xì)胞的損害，且不易造成免疫反應(yīng)，可是hCu/Zn-SOD的大規(guī)模生產(chǎn)和臨床醫(yī)學(xué)應(yīng)用遭受生產(chǎn)量和可溶的限定。根據(jù)定點(diǎn)突變更改hCu/Zn-SOD的一些氨基酸殘基能夠改進(jìn)其產(chǎn)銷量和質(zhì)量。

hCu/Zn-SOD包括兩個(gè)亞基，每一個(gè)亞基又包括4個(gè)胱胺酸（Cys）殘基，其相應(yīng)的部位分別是6、57、111和146，在其中Cys57和Cys146中間產(chǎn)生分子結(jié)構(gòu)內(nèi)二硫鍵，6位和111位是分散的胱胺酸殘基。周贊虎等運(yùn)用PCR定點(diǎn)突變技術(shù)性把hCu/Zn-SOD遺傳基因的Cys111密碼子基因突變?yōu)锳la111密碼子，根據(jù)任意同源重組將基因突變后的hCu/Zn-SOD融合到聚球藻Synechococcussp.PCC7942中并完成表述，表述物質(zhì)在80℃隔熱保溫30min后仍具備95%的魅力，耐高溫工作能力比純天然hCu/Zn-SOD擁有比較大的提升 。張琨等根據(jù)重合PCR技術(shù)性將純天然hCu/Zn-SOD遺傳基因的Cys6密碼子基因突變?yōu)锳la6密碼子，Cys111密碼子基因突變?yōu)镾er111密碼子，根據(jù)大腸埃希菌資產(chǎn)重組表述獲得改構(gòu)體蛋白質(zhì)rmhCu/Zn-SOD6Ala,111Ser，從1g濕菌體中得到的特異性蛋白質(zhì)總產(chǎn)量高過未變構(gòu)體的2倍，改構(gòu)體的耐熱性也得到大大提高。高淑彬各自搭建純天然hCu/Zn-SOD和Cys111基因突變成Ala111的基因突變hCu/Zn-SOD表達(dá)載體，并在大腸埃希菌中表述，其表述量都占菌體總蛋白的45%之上，基因突變hCu/Zn-SOD酶魅力和可靠性均高過純天然hCu/Zn-SOD，證實(shí)根據(jù)基因變異能夠改進(jìn)酶的特性。根據(jù)任意融合方法將基因突變的hCu/Zn-SOD遺傳基因融合到藍(lán)藻Synechoccussp.PCC7942性染色體上，臨床實(shí)驗(yàn)證實(shí)轉(zhuǎn)基因突變hCu/Zn-SOD遺傳基因的藍(lán)藻內(nèi)服后具備極強(qiáng)的抗氧化性功效，為進(jìn)一步科學(xué)研究開發(fā)設(shè)計(jì)藥物半衰期長(zhǎng)的可立即內(nèi)服的hCu/Zn-SOD確立了基本。Zhang等將hCu/Zn-SOD的6位和111位的胱胺酸（C）基因突變?yōu)榻z氨酸（S），搭建了3個(gè)突變體mhSOD1/C6S、mhSOD1/C111S和mhSOD1/C6S/C111S。結(jié)果顯示，與野生型對(duì)比，除開C6S基因突變使重組蛋白可溶表述減少之外，C111S和C6S/C111S基因突變均能提升重組蛋白在大腸埃希菌中的可溶表述，從而提升重組蛋白的生產(chǎn)量，且C111S基因突變實(shí)際效果好于C6S/C111S。除此之外，mhSOD1/C111S表明了更低的毒素和更強(qiáng)的淡斑和防輻射活力。因而，C111S基因突變是現(xiàn)代化大規(guī)模生產(chǎn)和開發(fā)設(shè)計(jì)重組人源SOD的一個(gè)合理對(duì)策。

三、根據(jù)融合蛋白技術(shù)性改進(jìn)

SOD的特性融合蛋白技術(shù)性就是指運(yùn)用基因工程技術(shù)技術(shù)性，將2段或兩段編號(hào)功能蛋白的遺傳基因有到達(dá)站聯(lián)接在一起并開展表述，進(jìn)而造成一種新的人力融合蛋白的方式 。由相對(duì)性較小的結(jié)構(gòu)域組裝成很大的多用途蛋白質(zhì)是自然進(jìn)化的一個(gè)主要要素。因而，在遺傳基因水準(zhǔn)上把不一樣的結(jié)構(gòu)域開展聯(lián)接，而且使其表述成融合蛋白，是產(chǎn)生多用途蛋白質(zhì)、減少原蛋白質(zhì)副作用及更新改造純天然蛋白質(zhì)的主要方式。因?yàn)橛行鹿δ艿鞍滋砑樱诤系鞍椎奶匦员惶嵘?，并形成新的微生物作用和活力，因此這類最新型的人力蛋白質(zhì)具備關(guān)鍵的理論依據(jù)和不確定性的使用使用價(jià)值。

1、PTD-SOD融合蛋白

細(xì)胞質(zhì)上沒有專一的SOD安全通道或蛋白激酶，外源性SOD無法進(jìn)到組織細(xì)胞內(nèi)充分發(fā)揮抗氧化性功效，因此局限了其臨床醫(yī)學(xué)運(yùn)用。HIV-1反式激活蛋白TAT的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域是一種廣譜性的能帶上大分子物質(zhì)透過小動(dòng)物細(xì)胞質(zhì)的小分子多肽，能夠處理SOD蛋白質(zhì)透膜有關(guān)難點(diǎn)。PTD能夠正確引導(dǎo)多種多樣活性多肽和蛋白質(zhì)進(jìn)到總體目標(biāo)體細(xì)胞，具備轉(zhuǎn)導(dǎo)速度更快、高效率和溫度適應(yīng)能力廣等優(yōu)勢(shì)，且可以通過血腦屏障。絕大多數(shù)PTD或與PTD共價(jià)鍵融合的蛋白質(zhì)在越過細(xì)胞質(zhì)后裝運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)而不是細(xì)胞核或別的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，因而PTD運(yùn)輸設(shè)備只適用在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)充分發(fā)揮作用的藥品分子結(jié)構(gòu)的裝運(yùn)。王宇等科學(xué)研究PTD4受體的Cu/Zn-SOD對(duì)大白鼠神經(jīng)細(xì)胞氧氣不足-復(fù)氧損害（HRI）的危害，發(fā)覺資產(chǎn)重組的PTD4-Cu/Zn-SOD融合蛋白能夠顯著降低HRI造成 的細(xì)胞壞死，進(jìn)而緩解大白鼠神經(jīng)細(xì)胞的HRI，證實(shí)了資產(chǎn)重組PTD4-Cu/Zn-SOD能夠高效率透過神經(jīng)細(xì)胞，改進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞缺血性再灌注損傷。Yao等在骨癌科學(xué)研究中發(fā)覺，臭氧在一定水平上參加了惡性腫瘤痛疼的快速發(fā)展和不斷，而資產(chǎn)重組PTD-Cu/Zn-SOD能夠變?nèi)踹@類功效，因而其在骨癌醫(yī)治中可當(dāng)作一種潛在性的輔助治療劑。Zhang等將所獲取的Mn-SOD、PTD-Mn-SOD和脂質(zhì)體Mn-SOD用以維護(hù)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）空氣氧化損害，結(jié)果發(fā)覺，與純天然Mn-SOD對(duì)比，PTD-Mn-SOD和脂質(zhì)體Mn-SOD可充分發(fā)揮更強(qiáng)的藥用價(jià)值。孟麗華和薛榮亮根據(jù)檢驗(yàn)PTD4-Cu/Zn-SOD進(jìn)到人星型膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)的熒光蛋白的劃分狀況，發(fā)覺PTD4-Cu/Zn-SOD融合蛋白可以越過細(xì)胞質(zhì)，且還可以減少因體細(xì)胞氧氣不足損害造成的細(xì)胞壞死。PTD與SOD開展整合的辦法簡(jiǎn)便易行，可供應(yīng)很多便宜、安全性、基酶的資產(chǎn)重組SOD產(chǎn)品。必須指出的是，雖然PTD-Cu/Zn-SOD融合蛋白具備優(yōu)良的透過細(xì)胞質(zhì)特點(diǎn)，但沒有機(jī)構(gòu)非特異，若是靜脈血管給藥也許會(huì)快速導(dǎo)進(jìn)毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞或紅細(xì)胞，不可以有效地抵達(dá)靶區(qū)充分發(fā)揮，因而必須進(jìn)一步改善構(gòu)造或給藥途徑以徹底解決其靶向治療難題。

2、PEP-SOD融合蛋白

PEP-1是一種人力制定的主要是用以轉(zhuǎn)導(dǎo)生物大分子蛋白質(zhì)的體細(xì)胞透過肽，它能效率高地帶上具備治療效果的蛋白質(zhì)進(jìn)到體細(xì)胞并充分發(fā)揮其分子生物學(xué)效用。Liu等創(chuàng)建了表述PEP-1-hMnSOD融合蛋白的表達(dá)載體，并在雙岐桿菌中取得成功表述了PEP-1-hMnSOD融合蛋白。在進(jìn)一步臨床實(shí)驗(yàn)中，將透膜性和可靠性較弱的hMnSOD根據(jù)PEP-1寄送到乙狀結(jié)腸炎癥細(xì)胞內(nèi)，根據(jù)對(duì)發(fā)炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8水準(zhǔn)及其乙狀結(jié)腸病理學(xué)損害檢驗(yàn)，發(fā)覺PEP-1-hMnSOD融合蛋白可以高效地緩解聚糖硝酸鈉誘發(fā)的潰瘍性腸胃病。因而內(nèi)服表述PEP-1-hMnSOD融合蛋白的雙岐桿菌工程菌可身為醫(yī)治潰瘍性腸胃病的新方式。

神經(jīng)系統(tǒng)干細(xì)胞移植已被證實(shí)是一種潛在性的醫(yī)治外傷性顱腦損傷的對(duì)策。Jia等探尋NSCs移殖相互配合PEP-1-SOD1一同醫(yī)治大白鼠腦栓塞的概率。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，PEP-1-SOD1能提升神經(jīng)元細(xì)胞的繁衍和分裂；身體試驗(yàn)說明，與獨(dú)立NSCs移殖對(duì)比，PEP-1-SOD1協(xié)同NSCs移殖對(duì)策對(duì)大白鼠TBI后的功能性修復(fù)有顯著的推動(dòng)作用。Yoo等研究了Cu/Zn-SOD對(duì)脂肪細(xì)胞來源于間充質(zhì)干細(xì)胞美容抗脊神經(jīng)缺血性損害的推動(dòng)作用。數(shù)據(jù)顯示PEP-1-SOD1和Ad-MSCs協(xié)同運(yùn)用進(jìn)一步加強(qiáng)了Ad-MSCs對(duì)神經(jīng)細(xì)胞缺血性損害的保障功效。相對(duì)性于PTD融合蛋白，PEP融合蛋白具備其特有優(yōu)點(diǎn)。PTD融合蛋白進(jìn)到體細(xì)胞后，所隨身攜帶的功能蛋白必須在人體細(xì)胞內(nèi)分子伴侶HSP90的協(xié)助下重伸縮才可以充分發(fā)揮其分子生物學(xué)效用，靶蛋白質(zhì)的生物活性取決于體細(xì)胞內(nèi)HSP90的重伸縮高效率，因而PTD融合蛋白技術(shù)性的醫(yī)學(xué)運(yùn)用得到了一定限定。而PEP融合蛋白可以立即帶上具備生物活性的功能蛋白進(jìn)到體細(xì)胞充分發(fā)揮分子生物學(xué)效用，與此同時(shí)它還具備轉(zhuǎn)導(dǎo)高效率、不含毒性及不會(huì)受到血清蛋白危害等優(yōu)點(diǎn)，這使體細(xì)胞透過肽PEP在運(yùn)用上更具備發(fā)展?jié)摿?，很有可能變成更適用于蛋白質(zhì)醫(yī)治的承載專用工具。

3、多用途融合蛋白

學(xué)者們?cè)囍鴮⒉灰粯幼饔玫牡鞍踪|(zhì)與SOD開展組成，將不一樣蛋白質(zhì)的優(yōu)點(diǎn)和特性結(jié)合在一起，以授予目地蛋白質(zhì)多種多樣新的特性和作用。周宇飛等為了更好地提高胸腺素α1（Thyα1）的穩(wěn)定度和免疫功能，選用胸腺素α1和人源SOD結(jié)合的對(duì)策，搭建了6His-hSOD-(G4S)1-Thyα1和6His-hSOD-(G4S)2-Thyα12個(gè)融合基因，并在畢赤酵母中完成了高質(zhì)量表述。資產(chǎn)重組表述的融合蛋白歷經(jīng)進(jìn)一步提純后完成了活力檢驗(yàn)，結(jié)果顯示這兩個(gè)融合蛋白不僅有SOD的活力，又有Thyα1的活力。盛本來等選用基因工程技術(shù)技術(shù)性根據(jù)大腸埃希菌制取一種兼顧人源SOD和過氧化氫酶（CAT）活力的多用途融合蛋白CAT-PTD-SOD，該融合蛋白絕大多數(shù)以兼顧SOD和CAT活力的可溶解方式存有。在0.033mol/L、乃至0.067mol/L的H2O2水溶液中，SOD活力在20min內(nèi)無顯然降低，證實(shí)其具有抗氧化性和溶解雙氧水的多重功效。潘劍茹等創(chuàng)建了SOD1和穿膜肽R9的融合蛋白表述質(zhì)粒GST（硫辛酸巰基轉(zhuǎn)移酶）-SOD1-R9，根據(jù)大腸埃希菌BL21（DE3）表述出具備多效抗氧化性作用的GST-SOD1-R9融合蛋白。該融合蛋白不但可以消除過多的特異性自由基，并且還可以修補(bǔ)或消除身體已被氧化損害的生物分子，并再造空氣氧化損害的含巰基蛋白質(zhì)。Pan等科學(xué)研究了GST-TAT-SOD對(duì)順鉑損害體細(xì)胞的保障功效，證實(shí)GST-TAT-SOD根據(jù)立即消除過多的體細(xì)胞內(nèi)氧自由基和提高人體細(xì)胞抗氧化性防御力，能夠消除順鉑醫(yī)治引發(fā)的成長(zhǎng)抑止和細(xì)胞壞死，因而GST-TAT-SOD能夠做為順鉑誘發(fā)的組織細(xì)胞受損的保護(hù)膜。除此之外，Pan等還根據(jù)小白鼠全身上下X射線輻射源試驗(yàn)，說明雙作用GST-TAT-SOD對(duì)X射線輻射源而致?lián)p害有一定的保護(hù)功效，可以有效的提升小白鼠肝臟和肝部的抗氧化能力、肝臟白髓數(shù)量和胰腺指數(shù)值等，不但明顯增強(qiáng)了X射線輻照度小白鼠休重年增長(zhǎng)率，并且增強(qiáng)了接納致死量直射小白鼠的成活率。GST-TAT-SOD的總體成效比阿米福汀好一些，因此 GST-TAT-SOD可當(dāng)作一種安全性的射線防護(hù)劑。

Luangwattananun等設(shè)計(jì)方案并研發(fā)了三作用融合蛋白CAT-CuZnSOD/6His-CuZnSOD-TAT（CS/S-TAT），與其說以前制定的6His-MnSOD-TAT/CAT-MnSOD（M-TAT/CM）對(duì)比，分子大小減少42%，其SOD和CAT活力各自提升22%和99%。在70℃孵育10min后，CS/S-TAT保存了54%的殘留SOD活力，而M-TAT/CM的SOD活力徹底清除。除此之外，在70℃時(shí)，CS/S-TAT的藥物半衰期比M-TAT/CM提升了5倍。該酶可以跨膜進(jìn)到哺乳類動(dòng)物體細(xì)胞，可做為空氣氧化損害體細(xì)胞的保護(hù)膜或治療劑。因而，此項(xiàng)工作中為制定和生成一種更平穩(wěn)的多用途抗氧化酶給予了參照。總而言之，多用途的融合蛋白在抗氧化性層面，通常比單一的抗氧化性蛋白質(zhì)具備很大的優(yōu)點(diǎn)。因而，融合蛋白的很大優(yōu)點(diǎn)使其有機(jī)會(huì)變成新一代抗氧化性藥品的強(qiáng)勁競(jìng)爭(zhēng)對(duì)手，為開發(fā)設(shè)計(jì)效率高抗氧化性蛋白質(zhì)開拓了有效途徑。

四、匯總與未來展望

SOD是動(dòng)物體內(nèi)一種主要的自由基去除劑，具備關(guān)鍵的生態(tài)學(xué)作用。很多病癥（如肌肉萎縮側(cè)索硬底化、心肌梗塞狹窄癥、腫瘤轉(zhuǎn)移和傳染性疾病等）的發(fā)生和發(fā)展趨勢(shì)與SOD欠缺或有誤伸縮相關(guān)。伴隨著SOD科學(xué)研究逐步推進(jìn)和工業(yè)生產(chǎn)經(jīng)營(yíng)規(guī)模逐步擴(kuò)張，SOD還被運(yùn)用于有機(jī)化學(xué)、分子生物學(xué)、食品科學(xué)和植物病害防止等眾多行業(yè)。可是受純天然SOD的理化性質(zhì)限制，如靜脈輸液后身體藥物半衰期僅為6min，內(nèi)服后在消化道中很容易被損壞而喪失功效，膜透過率劣等，這種要素使其在使用層面得到了非常大的限定?，F(xiàn)階段，大家對(duì)SOD蛋白質(zhì)開展了化學(xué)修飾、人力有機(jī)化學(xué)SOD仿真模擬物和應(yīng)用基因工程技術(shù)法制取SOD等領(lǐng)域的探尋，廣泛認(rèn)為根據(jù)基因工程技術(shù)制取重組人源SOD是較為經(jīng)濟(jì)發(fā)展、便捷、合理且安全可靠的方式 。伴隨著當(dāng)今生物工程的迅速發(fā)展趨勢(shì)，世界各國(guó)在生物發(fā)酵生產(chǎn)制造資產(chǎn)重組SOD的菌苗培育、增產(chǎn)菌開發(fā)設(shè)計(jì)和發(fā)醇技術(shù)的提升等領(lǐng)域都獲得了一定進(jìn)度。根據(jù)基因工程技術(shù)技術(shù)性生產(chǎn)制造重組人源SOD，既減少了其他來源SOD的抗原性難題，又解決了人源SOD的由來難題，而且能夠擺脫傳統(tǒng)手工藝限定，使我們能夠根據(jù)自身的意向定項(xiàng)更新改造目地蛋白質(zhì)。伴隨著科學(xué)研究的進(jìn)一步深層次，根據(jù)基因工程技術(shù)核心的生物技術(shù)將慢慢推動(dòng)資產(chǎn)重組SOD完成產(chǎn)業(yè)發(fā)展，運(yùn)用SOD開發(fā)設(shè)計(jì)的商品也可能獲得更加普遍的運(yùn)用。