過氧化氫酶(CAT)為鐵元素卟啉的融合酶,是一種普遍出現(xiàn)的抗氧化酶,能消除食品類、食用添加劑和調(diào)料在消毒滅菌、漂白劑、生產(chǎn)加工后造成或殘存的雙氧水,也可以消除乳制品等食物在紫外線照射時造成的雙氧水導(dǎo)致的臭味,因而測量CAT活力在食品檢測行業(yè)有著關(guān)鍵實際意義。酶的活性一般通過底物的變動來測量,而酶促反應(yīng)具備高寬比特異性、高效率、不穩(wěn)定和可調(diào)整等特性,因而測量CAT活力的辦法各種各樣。高錳酸鉀溶液滴定法因常用機(jī)器設(shè)備簡易,做為國家行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)和實驗教學(xué)一直被應(yīng)用,但高錳酸鉀溶液不穩(wěn)定,實驗試劑水溶液校準(zhǔn)難,儲存難,滴定管全過程中難以避免地存有很大的人為因素分辨偏差。當(dāng)今化學(xué)動力學(xué)分光光度法變成一大閃光點,董等以二苯胺磺酸鈉為底物進(jìn)行CAT著色驅(qū)動力分光光度法測量,但著色敏感度比較有限,H2O2表觀克分子吸光度指數(shù)ε<5.0×102L/(mol·cm)。文中以碘量法為基本,搭建碘酸鉀-木薯淀粉著色分光光度法測量CAT活力的新管理體系。在鹽酸物質(zhì)中,過氧化氫空氣氧化碘酸鉀轉(zhuǎn)化成碘,碘與木薯淀粉快速響應(yīng)展現(xiàn)深藍(lán)色,著色液在600nm光波長上有較大吸取峰。CAT催化反應(yīng)H202溶解,根據(jù)CAT添加前后左右OD值轉(zhuǎn)變值完成酶促反應(yīng)測量。該辦法簡易,基本原理清楚,耗品少,相對性高錳酸鉀溶液滴定法,檢出限更低,特別適合于微生物試品少量CAT活力剖析。本試驗用μtmol/mL(U/mL)來表明酶液的酶促反應(yīng),即lmL過氧化氫酶水溶液所耗費雙氧水摩爾質(zhì)量(μm01)。
一、試驗一部分
1、儀器設(shè)備與實驗試劑
7230G型由此可見光度計(深圳公司);電子分析天平(0.1mg,上海市天平儀器廠)。
CAT標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(上海市鼓臣生物科技有限責(zé)任公司)貯備液:配置濃度值lmg/mL(活力約為5000U/mL),碘量法校準(zhǔn);CAT切削液:0.1U/mL(應(yīng)用前由貯備液稀釋液);H202栽培基質(zhì)液:1μmol/mL(取0.6mL,3%H202稀釋液至500mL);0.1mol/LH2S04水溶液;0.01mol/L碘化鉀溶液;5g/L木薯淀粉液;0.1mol/L聚磷酸鹽緩沖液(pH=7.0)。
2、測定法
取50ml容量瓶一只,添加CAT樣液(酶促反應(yīng)低于2U/mL)1.00mE、H202栽培基質(zhì)液2.00mL,25℃水浴反映30min后馬上添加1.5mL鹽酸停止反映,加碘酸鉀5mL,60℃水浴加熱40min,制冷,加木薯淀粉3mL,滴定劑,以純凈水作參比液,在光波長600nm處測OD值A(chǔ),與此同時進(jìn)行酶試劑空白OD值A(chǔ)0測量,依據(jù)△A(△A=A0一A)明確過氧化氫酶活力E。
二、結(jié)果探討
1、光譜圖與較大消化吸收光波長
不一樣管理體系光譜圖見圖1。木薯淀粉與碘化鉀溶液在可見光波長區(qū)無消化吸收峰(圖1曲線圖1);木薯淀粉、碘酸鉀與雙氧水水溶液中,雙氧水空氣氧化碘酸鉀,淀粉溶液呈深藍(lán)色,600nm上有較大消化吸收(圖1曲線圖3),峰形銳利,最高值較高,H2O2表觀克分子吸光度指數(shù)ε600=2.79×104L/(mol·cm);添加CAT后,著色受抑止(圖1曲線圖2),但峰位未發(fā)生改變,這表明反映僅出現(xiàn)于雙氧水與碘酸鉀中間,著色水平與雙氧水成分相關(guān)。試驗選擇600nm作測量光波長。
2、碘酸鉀使用量危害
僅對于非酶管理體系(E=0U/mL),單純性調(diào)查了碘酸鉀使用量危害。結(jié)果顯示,A隨碘酸鉀容積擴(kuò)大,在0~3mL中間,增長幅度較快,很多的碘酸鉀被氧化;在3~5mL中間,增長幅度變緩,這時候的碘酸鉀關(guān)鍵做為助有機(jī)溶劑,I2是非極性分子,水溶差,過多碘酸鉀促進(jìn)碘合正離子產(chǎn)生(I2 I–=I–3),溶解性提高。顯而易見,過多碘酸鉀合理緩解了著色自然環(huán)境,5mL時A穩(wěn)定不會改變。試驗挑選5mL碘酸鉀。
3、木薯淀粉使用量
用該方式取50ml容量瓶一只,添加CAT樣液(酶促反應(yīng)低于2U/mL)1.00mE、H202栽培基質(zhì)液2.00mL,25℃水浴反映30min后馬上添加1.5mL鹽酸停止反映,加碘酸鉀5mL,60℃水浴加熱40min,制冷,加木薯淀粉3mL,滴定劑,以純凈水作參比液,在光波長600nm處測OD值A(chǔ),與此同時進(jìn)行酶試劑空白OD值A(chǔ)0測量,依據(jù)△A(△A=A0一A)明確過氧化氫酶活力E。別的標(biāo)準(zhǔn)不會改變,調(diào)查了木薯淀粉使用量危害。結(jié)果顯示,在0~2.75mL中間,A隨木薯淀粉容積擴(kuò)大,2.75mL后,A趨向穩(wěn)定。試驗挑選3mL木薯淀粉作鉻黑T。
4、鹽酸使用量
取50ml容量瓶一只,添加CAT樣液(酶促反應(yīng)低于2U/mL)1.00mE、H202栽培基質(zhì)液2.00mL,25℃水浴反映30min后馬上添加1.5mL鹽酸停止反映,加碘酸鉀5mL,60℃水浴加熱40min,制冷,加木薯淀粉3mL,滴定劑,以純凈水作參比液,在光波長600nm處測OD值A(chǔ),與此同時進(jìn)行酶試劑空白OD值A(chǔ)0測量,依據(jù)△A(△A=A0一A)明確過氧化氫酶活力E。別的標(biāo)準(zhǔn)不會改變,調(diào)查鹽酸容積對顯色反應(yīng)危害,并同歩進(jìn)行pH測量(圖2)。結(jié)果顯示,當(dāng)V(H2SO4)=1.5mL時,pH=1.80,著色最徹底,A值超過較大。0.1mol/LH2SO4水溶液最好使用量為1.5mL。