海產(chǎn)品口味美味、營養(yǎng)豐富，備受顧客的鐘愛，殊不知，海產(chǎn)品非常容易腐壞霉變，導致很大的財產(chǎn)損失。因為微生物菌種的成長和侵入是造成 海產(chǎn)品腐壞的首要要素，因而海產(chǎn)品的儲藏全過程中對生物的抑止十分關鍵。超低溫儲藏技術性是應用最開始，也是使用最廣泛的海產(chǎn)品冷藏技術性。超低溫會使微生物菌種的生理學功能產(chǎn)生主要的轉變，例如膜流通性減少，核苷酸二級結構可靠性提高，基因表達、漢語翻譯及蛋白質伸縮的效果下降等。在較低溫度下有一些微生物菌種仍能以一定的發(fā)育速度生長發(fā)育，即便生長發(fā)育比較慢。腐壞希瓦氏菌是一種耐冷菌，在0℃下也可以生長發(fā)育、繁育，其在有氧運動冷藏或冷凍情況下是多種多樣海產(chǎn)品的特殊腐壞菌，造成冷凍海產(chǎn)品的腐壞霉變，這明顯減少了海產(chǎn)品的質量，極有可能造成 食品衛(wèi)生安全難題。由于海產(chǎn)品冷藏的關鍵經(jīng)濟價值，深入了解腐壞希瓦氏菌超低溫融入的分子結構體制，能夠輔助預測分析腐壞菌在冷凍食品類中的個人行為，有利于開展更確切的風險性預估和預防。

研究發(fā)現(xiàn)，微生物菌種在超低溫功效下易造成冷應激狀態(tài)，轉化成一系列的抗超低溫蛋白質，稱之為冷激蛋白質。病菌冷激蛋白質是一類包括核苷酸融合冷休克結構域的高寬比傳統(tǒng)的小分子水蛋白質（～7.4ku），能夠做為分子伴侶與單鏈DNA或單鏈RNA融合，阻攔DNA或RNA在較低溫度下產(chǎn)生二級結構，進而推動轉錄和翻譯。除此之外，冷激蛋白質還參加病菌的好幾個生理學生物化學全過程，如：細胞質的流通性，病菌一切正常發(fā)育與分裂，營養(yǎng)成分威逼，病菌的感病等。冷激蛋白質對病菌在低溫時修復生長發(fā)育和充分發(fā)揮體細胞各種各樣作用是十分關鍵的，是分析微生物菌種超低溫融入體制的重要蛋白質。殊不知，現(xiàn)階段有關腐壞希瓦氏菌冷激蛋白質的科學研究很少有報導。

病菌一般有著好幾個冷激蛋白質，且冷激蛋白質的功效規(guī)律性十分復雜，并不是全部冷激蛋白質都受超低溫誘發(fā)表述。根據(jù)對NCBＩ數(shù)據(jù)庫查詢中腐壞希瓦氏菌方式菌種的全基因組序列查找，發(fā)覺腐壞希瓦氏菌中存有3個典型性冷激蛋白質，現(xiàn)階段并未看到相關其關鍵冷激蛋白質及有關作用的科學研究。文中以海產(chǎn)品的腐壞希瓦氏菌為研究對象，根據(jù)PCR擴增得到海產(chǎn)品腐壞希瓦氏菌的3個冷激蛋白質基因序列，在這個基礎上根據(jù)生物信息學剖析腐壞希瓦氏菌冷激蛋白質的理化性質、構造和作用特點等，致力于為冷激蛋白質在腐壞希瓦氏菌超低溫融入全過程中的功用科學研究，及其對海產(chǎn)品中腐壞希瓦氏菌的抑止給予參照。

1 原材料與方式

1.1 原材料與實驗試劑

腐壞希瓦氏菌為本試驗室自腐壞的冷凍大菱鲆中分離出來所得的，于-80℃儲藏。聚合酶鏈反應（Polemerasechainreaction，PCR）引物設計授權委托生工生物工程項目（上海市）技術咨詢有限責任公司生成

EasyTaqRDNAPolymerase，北京市都是金生物科技有限責任公司；病菌基因DNA獲取檢測試劑盒、GeneRed核酸染料，天根生化高新科技（北京市）有限責任公司；Biowest瓊脂糖、LB營養(yǎng)成分瓊脂粉、LB營養(yǎng)成分骨頭湯，青島市高科園海博生物技術性有限責任公司。

1.2 儀器設備與機器設備

防揮發(fā)梯度方向PCR，英國Eppendrof企業(yè)；凝膠電泳及配套設施機器設備，英國Bio-Bad公司；少量冷凍離心機，英國Thermo企業(yè)。

1.3 菌種鑒定及冷激蛋白質遺傳基因的復制與轉錄組測序

活性本試驗室儲藏的腐壞希瓦氏菌，依照基因DNA獲取檢測試劑盒的操作流程獲取基因DNA，運用病菌16SrRNA遺傳基因通用引物27F和1492R開展PCR擴增，得到腐壞希瓦氏菌的16SrRNA遺傳基因（表1）。選用NCBＩ查找近緣腐壞希瓦氏菌菌種基因信息內容（GenBank：CP002457.1），根據(jù)注解冷激蛋白質遺傳基因以及上、中下游編碼序列，設計方案引物設計（表1），開展冷激蛋白質的Csp1589，Csp1376和Csp2252遺傳基因的增加。PCR擴增標準為94℃5min；94℃30s，Tm℃30s（詳細表1），72℃45s，循環(huán)系統(tǒng)三十次。PCR物質經(jīng)2%的瓊脂糖電泳電泳原理檢驗后送至上海生工轉錄組測序。

1.4 系統(tǒng)軟件產(chǎn)生樹的搭建

自NCBＩ數(shù)據(jù)庫查詢得到大腸埃希菌（NC_000913.3）的9個冷激蛋白質（CspA～Ｉ），以FASTAfile方式儲存。根據(jù)手機軟件ClustalX對轉錄組測序所得的腐壞希瓦氏菌冷激蛋白質和大腸埃希菌的冷激蛋白質開展序列比對，并且用Mega7.0中的臨接法（Neighbor-jioningmethod，NＪ）為其搭建系統(tǒng)軟件產(chǎn)生樹，步幅值（Bootstrapvalues）為1000。

1.5 冷激蛋白質的理化性質及結構域的預測分析

ExPASy網(wǎng)址中的一個專用工具ProtParam來預測分析腐壞希瓦氏菌冷激蛋白質的基本上生理學、生物化學特點，用PSORTwwwServer中的PSORTPrediction專用工具預測分析冷激蛋白質體細胞精準定位，用TMHMMServer2.0預測分析冷激蛋白質跨膜地區(qū)，用SignalＩP5.0線上預測分析冷激蛋白質信號肽，用SMART預測分析冷激蛋白質結構域的產(chǎn)生以及其作用，用在線軟件NCBＩConservedDomainSearch開展其碳水化合物保守序列剖析。

1.6 構造預測分析與實體模型品質評定

應用PSＩPRED預測分析腐壞希瓦氏菌冷激蛋白質的二級結構。將腐壞希瓦氏菌冷激蛋白質的氨基酸序列遞交到SWＩSS-MODEL網(wǎng)址開展三級構造的預測分析。將搭建的蛋白質三級實體模型用PROCHECK和Ｖerify3D開展品質評定。PROCHECK和Ｖerify3D是SAＶESv5.0中的構造評定服務項目。

1.7 互作蛋白質及配位融合結構域的預測分析

用STRＩNG專用工具明確在活身體與腐壞希瓦氏菌冷激蛋白質存有相互影響的蛋白質。這類相互影響既包含蛋白中間立即的物理學相互影響，也包含蛋白中間間接性的作用關聯(lián)性。將從SWＩSS-MODEL獲得的模式文檔鍵入COACH，以預測分析腐壞希瓦氏菌冷激蛋白質潛在性的配位融合結構域。