溶菌酶（Lysozyme，EC3.2.1.17）又被稱作胞壁質(zhì)酶（Muramidase）、N-乙酰胞壁質(zhì)聚糖核糖核苷酸（N-acetylmuramideglycanohydrlase），能夠目的性地水解反應(yīng)細(xì)菌細(xì)胞壁上肽聚糖的β-1，4糖苷鍵，促使體細(xì)胞在融解身亡的與此同時(shí)，不毀壞其他機(jī)構(gòu)，是一種純天然、安全系數(shù)優(yōu)良的農(nóng)藥殺菌劑和添加劑，具備抑菌、消腫、抗病毒治療等功效，可普遍使用于食品類微生物防腐蝕、藥業(yè)、日用化工廠等領(lǐng)域?，F(xiàn)階段研究表明，生雞蛋雞蛋清是溶菌酶生產(chǎn)制造的具體原材料，其溶菌酶的成分可做到0.2%～0.4%，殊不知，雞蛋清中富含很多種蛋白，需對(duì)雞蛋清中的溶菌酶開展分離出來(lái)純化。

現(xiàn)階段，常見的溶菌酶提純方法包含結(jié)晶法、親和力膜色譜分析、離子交換、超濾膜法等。Curcio等選用靜態(tài)數(shù)據(jù)膜結(jié)晶法以NaCl為混凝劑，MgCl₂水溶液為過(guò)柱液，醋酸鈉溶液為緩沖溶液調(diào)整雞蛋清液pH值，靜放1d后溶菌酶以結(jié)晶方式進(jìn)行析出，其使用簡(jiǎn)易，殊不知生產(chǎn)制造時(shí)間長(zhǎng)，原材料利用效率低，且制取的溶菌酶純凈度較低。Ho用活力紅120對(duì)帶磁殼聚糖脂質(zhì)體表層完成改性材料，并選用聚磷酸鹽緩沖溶液做為過(guò)柱液，制取的溶菌酶解析率是92.6%，利用率為89.1%，其制取的溶菌酶純凈度高，殊不知實(shí)際操作難度系數(shù)很大，成本增加，無(wú)法運(yùn)用于工業(yè)生產(chǎn)。離子交換可運(yùn)用樹脂吸附與蛋白相互之間的結(jié)合性不一樣具有分離出來(lái)實(shí)際效果。余海芬等選用正離子互換環(huán)氧樹脂法，以硫酸銨為過(guò)柱液獲取雞蛋清溶菌酶，制取溶菌酶比酶活達(dá)9500U/mg，其使用簡(jiǎn)易，生產(chǎn)制造周期時(shí)間短，高效率，合適工業(yè)生產(chǎn)。超濾膜法以陶氏反滲透膜兩邊壓差為驅(qū)動(dòng)力，根據(jù)操縱膜直徑的大小開展蛋白的分離出來(lái)。Mayani等用超濾膜法所制成的雞蛋清溶菌酶純品純凈度達(dá)96%，利用率為75%，其使用簡(jiǎn)易、迅速，相較其他方式標(biāo)準(zhǔn)柔和，是微生物工業(yè)生產(chǎn)行業(yè)中較有潛質(zhì)的蛋白分離出來(lái)技術(shù)性。綜上所述，目前的溶菌酶獲取方式均存有一定的缺點(diǎn)，因而，本科學(xué)研究協(xié)作應(yīng)用離子交換、超濾膜法，科學(xué)研究一種新式、高效率的純化溶菌酶的方式 ，即采用724正離子互換環(huán)氧樹脂對(duì)溶菌酶開展非特異吸咐，過(guò)柱后經(jīng)二步超濾膜得到特制溶菌酶，經(jīng)單要素實(shí)驗(yàn)、Box-Behnken實(shí)驗(yàn)提升純化加工工藝主要參數(shù)，并對(duì)純化后的溶菌酶酶學(xué)特性開展基本表現(xiàn)。

1 原材料與方式

1.1 原材料、實(shí)驗(yàn)試劑與儀器設(shè)備

新鮮生雞蛋，市面上；溶菌酶標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，南京建成微生物有限責(zé)任公司；溶壁微革蘭陰性桿菌（MicrococcuslysodeikticusFleming，儲(chǔ)藏序號(hào)：GＩM1.132），廣東微生物菌種儲(chǔ)藏核心；724孔眼酸性正離子互換環(huán)氧樹脂，鄭州市勤實(shí)高新科技有限責(zé)任公司；蛋白標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，南京建成微生物有限責(zé)任公司；其他實(shí)驗(yàn)試劑均為分析純級(jí)實(shí)驗(yàn)試劑。

pH計(jì)，上海市梅特勒-托利多儀器設(shè)備有限責(zé)任公司；快速冷凍離心機(jī)，安徽省嘉文儀器設(shè)備武器裝備有限責(zé)任公司；由此可見-紫外線光度計(jì)，上海市棱光技術(shù)性有限責(zé)任公司；YXQ-LＳ-18ＳＩ立柱式工作壓力滅菌設(shè)備、ＳW-GＪ-1R凈化工作臺(tái)，上海博訊實(shí)業(yè)公司有限責(zé)任公司診療機(jī)械廠；GXZ-300D生化培養(yǎng)箱，寧波市東南方儀器設(shè)備有限責(zé)任公司；DHG-9194A電加熱干燥烘箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)儀器有限責(zé)任公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方式

1.2.1 獲取溶菌酶的生產(chǎn)流程

雞蛋清拌和、過(guò)慮→環(huán)氧樹脂預(yù)備處理（724孔眼酸性正離子互換環(huán)氧樹脂獲取雞蛋清液中的溶菌酶，硫酸、氫氧化鈉溶液溶液的濃度為1mol/L，泡浸時(shí)間均為10h）→吸咐→過(guò)柱→超濾技術(shù)輔助純化、除鹽→低溫干燥得溶菌酶純品。

1.2.2 加工工藝提升

1.2.2.1 單要素實(shí)驗(yàn)

以環(huán)氧樹脂使用量、雞蛋清滲瀝液pH值、過(guò)柱液濃度值、過(guò)柱時(shí)間為調(diào)查要素，測(cè)量過(guò)柱液中溶菌酶濃度值（mg/mL）及比魅力（U/mg），并以溶菌酶的比魅力（U/mg）為指標(biāo)值調(diào)查陽(yáng)離子交換的單要素實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.2.2.2 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)

在單要素實(shí)驗(yàn)的根基上，挑選環(huán)氧樹脂使用量（A）、過(guò)柱液NaCl濃度值（B）、雞蛋清滲瀝液pH值（C）、過(guò)柱時(shí)間（D）4個(gè)要素，每一個(gè)要素選擇低、中、高3個(gè)水準(zhǔn)（表1），選用4要素3水準(zhǔn)的回應(yīng)斜面方式設(shè)計(jì)方案實(shí)驗(yàn)，并以溶菌酶比魅力為指標(biāo)值，明確最好獲取加工工藝。

1.2.2.3 超濾膜實(shí)驗(yàn)

將陽(yáng)離子交換所獲得比魅力最大的過(guò)柱液，放置不一樣轉(zhuǎn)速比、時(shí)間下完成離心式超濾膜（截流分子質(zhì)量為50ku），棄頂層液，所得的下一層液于6500×g，20min離心式開展二步超濾膜（3ku），留頂層提取液，并且以酶成分、比魅力為調(diào)查指標(biāo)值，研究最佳超濾膜標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.3 溶菌酶成分及比魅力測(cè)定法

1.2.3.1 溶菌酶成分的測(cè)量

參照《雞蛋蛋清中溶菌酶的測(cè)定分光光度法》（GB/T25879-2010），略微修改。以0.9%NaCl水溶液為對(duì)照品液，在光波長(zhǎng)281nm處先后測(cè)量各溶菌酶規(guī)范液OD值，制作標(biāo)曲。取試件1mL，用0.9%NaCl溶液稀釋滴定劑至25mL，攪拌，在光波長(zhǎng)281nm處測(cè)量試件水溶液的OD值，平行測(cè)定3次，由標(biāo)曲線性回歸方程測(cè)算樣品的溶菌酶濃度值。

1.2.3.2 溶菌酶比魅力的測(cè)量

參考《溶菌酶活性檢測(cè)方法》（GB/T30990-2014），略微修改。于被測(cè)管內(nèi)添加0.4mL被測(cè)酶液，再添加2mL溶壁微革蘭陰性桿菌菌液后開始記時(shí)，在光波長(zhǎng)450nm處各自反映15s和75s后，紀(jì)錄OD值A(chǔ)₁₅和A₇₅。按每分較OD₄₅₀值降低0.001為一個(gè)魅力企業(yè)（U）界定，測(cè)算酶魅力，見式（1）。

式中，E_A—溶菌酶比魅力（U/mg）；E_w—測(cè)定酶液中溶菌酶成分（mg）。

1.2.4 溶菌酶相對(duì)性酶活的測(cè)量

測(cè)量溶菌酶在不一樣標(biāo)準(zhǔn)下的酶活，計(jì)酶活最大值為100%，相對(duì)性酶活為在不一樣標(biāo)準(zhǔn)下酶活與最大酶活的百分?jǐn)?shù)。

1.2.5 溶菌酶商品純凈度評(píng)定

參考Laemmli等的聚正丁酸凝膠電泳法（SDS-PAGE）檢驗(yàn)1.2.1節(jié)中吸咐溶菌酶的過(guò)柱液和超濾膜酶液的純凈度。電泳原理完畢后，應(yīng)用凝膠成像儀收集圖象，ＩmageLab

5.2.1 手機(jī)軟件剖析圖象。

1.2.6 雞蛋清溶菌酶一部分酶學(xué)特性的研究

以1.2.1節(jié)中歷經(jīng)提升后制成的溶菌酶為試品酶，研究pH值、溫度、金屬離子、表活劑對(duì)溶菌酶酶活的危害，及其該酶的環(huán)境溫度和pH可靠性。

1.2.6.1 pH值對(duì)溶菌酶酶活的危害

應(yīng)用不一樣pH值（3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0）的鹽水配置成濃度值為20g/mL的酶液，25℃水浴30min后，按1.2.4節(jié)上述方式測(cè)量相對(duì)性酶活（%）。

1.2.6.2 溫度對(duì)溶菌酶酶活的危害

應(yīng)用pH數(shù)值7.0的鹽水配置成濃度值為20g/mL的酶液，水浴加熱至不一樣溫度（20，30，40，50，60，70，80℃），隔熱保溫30min后，測(cè)量相對(duì)性酶活（%）。

1.2.6.3 溶菌酶的pH可靠性

應(yīng)用不一樣pH值（3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0）的鹽水配置成濃度值為20μg/mL的酶液，并各自反映30，60，90min后，測(cè)量相對(duì)性酶活（%）。

1.2.6.4 溶菌酶的溫度可靠性

應(yīng)用pH數(shù)值7.0的鹽水，配置成濃度值為20μg/mL的酶液，水浴加熱至不一樣溫度（30，40，50，60，70，80℃），隔熱保溫30，60，90min后，測(cè)量相對(duì)性酶活（%）。

1.2.6.5 金屬離子對(duì)溶菌酶酶活的危害

用純凈水配置成濃度值為20μg/mL的酶液，添加等大小的不一樣金屬離子（Na ，K ，Ca² ，Mn² ，Zn² ，Mg² ）水溶液，使水溶液中最后金屬離子成分為0.01mol/L，與此同時(shí)設(shè)空白試驗(yàn)，25℃水浴30min后，測(cè)量相對(duì)性酶活（%）。

1.2.6.6 表活劑對(duì)溶菌酶酶活的危害

應(yīng)用pH數(shù)值7.0的鹽水配置成濃度值為20μg/mL的酶液，等容積添加摩爾分?jǐn)?shù)10%的凡士林、Tween20、Tween40、Tween80，設(shè)空白試驗(yàn)，25℃水浴30min后，測(cè)量相對(duì)性酶活（%）。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理方法

選用Design-Expert8.0.6手機(jī)軟件響應(yīng)面設(shè)計(jì)方案、數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析、回歸分析創(chuàng)建，選用OriginPro8.0作圖；實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)信息選用SPSS19.0手機(jī)軟件開展數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與剖析

2.1 陽(yáng)離子交換單要素提升

2.1.1 環(huán)氧樹脂使用量提升

由圖1得知，當(dāng)雞蛋清環(huán)氧樹脂之比10∶2時(shí)，溶菌酶比魅力做到最高值14997.78U/mg，以后伴隨著環(huán)氧樹脂成分的提升，溶菌酶比魅力遲緩降低。而酶成分隨雞蛋清環(huán)氧樹脂比的提高而提升，在雞蛋清環(huán)氧樹脂比抵達(dá)10∶2.5以后，提升遲緩。由此可見，當(dāng)雞蛋清環(huán)氧樹脂之比10∶2.5時(shí)，所得的溶菌酶的比魅力較高，環(huán)氧樹脂使用量適合，適合獲取分離出來(lái)溶菌酶。2.1.2雞蛋清滲瀝液pH值提升由圖2得知，當(dāng)雞蛋清滲瀝液pH數(shù)值9時(shí)，溶菌酶比魅力最大（16048.71U/mg），當(dāng)pH值太高高或過(guò)低時(shí)，酶的比魅力都是會(huì)有一定的減少，很有可能因?yàn)閜H值更改了雞蛋清滲瀝液中酶的通電情況，偏酸、過(guò)堿都是會(huì)對(duì)酶構(gòu)造產(chǎn)生不可逆的毀壞，使酶的比魅力降低。與酶成分做到最高處對(duì)比（pH8），pH9時(shí)酶成分降低，而比魅力卻上升，即陽(yáng)離子交換純化雞蛋清溶菌酶的挑選pH數(shù)值9做事后實(shí)驗(yàn)。