2.3 超濾膜純化標(biāo)準(zhǔn)可靠性設(shè)計

將以上提升標(biāo)準(zhǔn)制取酶液做進(jìn)一步超濾膜純化提升，將酶液放置截流量為50ku的超濾離心管中，于4000～6000×g，離心式5～15min，去除雜蛋白質(zhì)，棄去離心管架頂層液。再將下一層液放置截流量為3ku的超濾離心管中，于6500×g，離心式20min，保存頂層截流液，測量其酶成分及比魅力，結(jié)果如表5所顯示。得知，伴隨著轉(zhuǎn)數(shù)的上升，酶成分逐步上升，而溶菌酶比魅力呈先升高后降低的發(fā)展趨勢，推斷因為離心式轉(zhuǎn)速比過低促使溶菌酶被一部分截流在頂層，而離心式轉(zhuǎn)速比過高，雖能將溶菌酶所有通過下一層，但一部分雜蛋白質(zhì)不可以有效的除去，一樣不被截流，或者溶菌酶在快速離心式歷程中有一定的損害，致酶魅力降低。且伴隨著離心式時間增加，比魅力有所增加，殊不知離心式時間不適合太長，太長的離心式時間會使工作效率減少，不利大規(guī)模生產(chǎn)。故當(dāng)溶菌酶比魅力為最高值時，挑選50ku超濾離心管，在5000×g標(biāo)準(zhǔn)下離心式10min。

2.4 溶菌酶純凈度檢測

將最佳陽離子交換所得的的過柱液與最佳的超滲瀝液各自抽樣開展ＳDＳ-PAGE凝膠電泳實驗，電泳原理結(jié)果如圖所示8和圖9所顯示。

由圖8、圖9比照得知，過柱液和超滲瀝液均可在14.4ku看到顯著雜帶，與雞蛋清溶菌酶的相對性分子質(zhì)量相符合。除此之外，只歷經(jīng)陽離子交換的過柱液的雜蛋白質(zhì)及殘渣鹽較多，危害純凈度，而過柱液歷經(jīng)二步超濾膜后，雜蛋白質(zhì)、殘渣鹽較少，獲取的溶菌酶純凈度較高。

采用歷經(jīng)陽離子交換協(xié)作二步超濾膜法純化的雞蛋清溶菌酶液，測量溶菌酶的純凈度，結(jié)果如圖所示10所顯示，并且用ＩmageLab5.2.1手機(jī)軟件對圖片開展剖析，所得的數(shù)據(jù)信息如表6所顯示。

由表6得知，超滲瀝液中蛋白質(zhì)分子品質(zhì)在14.4～15.1ku，合乎雞蛋清溶菌酶分子質(zhì)量的劃分范疇。除泳道4外，其他泳道均值為2290619，蛋白標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的第6雜帶（溶菌酶雜帶）成分為0.125μg/μL，上樣量為5μL，相對性濃度值數(shù)值619080，實驗測出超滲瀝液中蛋白質(zhì)含量為2.40μg/μL，上樣量10μL（上樣緩沖溶液∶試品（容積比）=4∶1），相對性濃度值數(shù)值2290619，故估計得溶菌酶純凈度為96.36%，測出該溶菌酶的比魅力為23718.61U/mg。

2.5 溶菌酶的酶學(xué)特性研究

2.5.1 pH值對溶菌酶酶活的危害

由圖11得知，隨pH值的持續(xù)上升，溶菌酶的相對性酶活呈先升高后降低的發(fā)展趨勢，溶菌酶在pH5～8均可維持85%之上的相對性酶活，在pH數(shù)值3～4時仍有70%之上的相對性酶活，在pH數(shù)值7.0時，酶魅力做到最高值，可推斷，溶菌酶的適宜pH值約為7.0。pH值危害溶菌酶酶活的因素可能是因為pH值的更改對底物溶壁微革蘭陰性桿菌的情況造成危害，也可能是pH值促使酶的通電情況更改，進(jìn)而危害酶的活性。

2.5.2 溫度對溶菌酶酶活的危害

由圖12得知，在20～60℃時，溶菌酶相對性酶活隨環(huán)境溫度上升遲緩升高，且相對性酶活均在78%之上，溫度功效覆蓋面廣；在60℃時，酶活做到最大值，若再次提溫，則酶活降低較快。其很有可能是由于超低溫時隨氣溫升高分子熱運(yùn)動加速，提升 了反應(yīng)速率，而當(dāng)氣溫抵達(dá)60℃后，隨反映溫度的上升，雞蛋清溶菌酶慢慢降解，促使酶促反應(yīng)降低。

2.5.3 溶菌酶的pH可靠性

由圖13得知，溶菌酶在呈酸性及中性化的條件下相對穩(wěn)定，在pH4.0～7.0的范疇內(nèi)，相對性酶活維持在88%之上。而在偏堿自然環(huán)境下，伴隨著時間增加，相對性酶活慢慢降低，且隨pH值上升，變化幅度越來越大，在pH8.0的鹽水中解決90min，酶魅力降為原始的80%，而在pH9.0的鹽水中解決90min，酶魅力降為原始的65%。故溶菌酶在偏酸堿性及中性化情況下比較平穩(wěn)，經(jīng)過酸、過堿易使其降解，這與傅婷等的分析結(jié)果相近，可能是因為溶菌酶在酸堿性自然環(huán)境中為碳鏈構(gòu)像隨酸值轉(zhuǎn)變危害并不大，構(gòu)造相對穩(wěn)定。

2.5.4 溶菌酶的溫度可靠性

由圖14得知，在30～60℃時，溫度對酶活危害并不大，溶菌酶維持較高可靠性；在70℃隔熱保溫一段時間，酶活遲緩降低，90min后，比魅力減少為初值的78%；而在80℃隔熱保溫一段時間，酶活降低速度較高，90min后，比魅力降為初值的52%?？赡苁请S環(huán)境溫度上升，溶菌酶轉(zhuǎn)性降解水平上升，降解速率加速。

2.5.5 金屬離子對溶菌酶酶活的危害

由圖15得知，Na 、Ca² 對溶菌酶有極強(qiáng)的激話功效；K 對溶菌酶激話功效較差；而Zn² 對溶菌酶活力有極強(qiáng)的抑制效果；其他金屬離子（Mg² 、Mn² ）對溶菌酶活力無顯著危害。故除少數(shù)離子對溶菌酶活力有抑制效果外，絕大多數(shù)金屬離子對酶活不容易造成干擾或具有激發(fā)功效，即絕大多數(shù)金屬離子與溶菌酶具備優(yōu)良的搭配功效。

2.5.6 表活劑對溶菌酶酶活的危害

由圖16得知，幾類表活劑對雞蛋清溶菌酶活力都是有一定的抑制效果，在其中Tween20、Tween40、Tween80對酶魅力危害較小，相對性酶魅力維持在84%之上，而歷經(jīng)摩爾分?jǐn)?shù)10%的凡士林解決的溶菌酶相對性酶魅力降到78%。這很有可能與表活劑對溶菌酶構(gòu)造造成危害相關(guān)；表活劑的高粘度特點(diǎn)會減少溶菌酶的活力，因此在溶菌酶制取環(huán)節(jié)中應(yīng)降低或不應(yīng)用表活劑。

3 結(jié)果

文中對陽離子交換協(xié)作超濾技術(shù)獲取雞蛋清中溶菌酶的技術(shù)完成提升，并對溶菌酶的含量和一部分酶學(xué)特性開展研究，關(guān)鍵依據(jù)如下所示：

1）根據(jù)單要素和Box-Behnken實驗獲得最佳獲取加工工藝標(biāo)準(zhǔn)為：環(huán)氧樹脂使用量為雞蛋清滲瀝液容積為24.2%，過柱液為1.00mol/LNaCl，雞蛋清滲瀝液pH數(shù)值9.10，過柱時間為62.61min，這時基礎(chǔ)理論預(yù)測分析酶液的比魅力為21041.1U/mg。對所獲取的技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)開展認(rèn)證獲得具體酶液的比魅力為20509.58U/mg。將提升后的酶液開展超濾膜提升，并開展SDS-PAGE純凈度評定，所得的二步超濾膜標(biāo)準(zhǔn)為：應(yīng)用50ku超濾膜，在5000×g標(biāo)準(zhǔn)下離心式10min，再用3ku超濾膜，6000×g離心式20min，最后測得溶菌酶的比魅力為23718.61U/mg，純凈度為96.36%。

2）根據(jù)對溶菌酶的酶學(xué)特性的分析得知，溶菌酶適宜pH數(shù)值7.0，pH值在4.0～7.0范疇內(nèi)可靠性不錯；適宜反映溫度為60℃，超低溫下耐熱性優(yōu)良，在較高溫度下酶活降低較快；Na 、Ca² 對酶有較強(qiáng)激話功效，K 有一定激話功效，Mg² 、Mn² 對酶活危害并不大，Zn² 對酶有顯著抑制效果；表活劑凡士林、Tween20、Tween40、Tween80均對溶菌酶有抑制效果，凡士林的抑制效果較強(qiáng)。

文中根據(jù)單要素及響應(yīng)面法提升陽離子交換-超濾膜法協(xié)作獲取雞蛋清中溶菌酶最好的技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)，并對所獲取溶菌酶的酶學(xué)特性開展研究，為下一步現(xiàn)代化及產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)制造打下基礎(chǔ)。