乳酸菌乳革蘭陰性桿菌胞外含糖量（EPS）為乳酸菌飲料在成長新陳代謝全過程中代謝到植物細胞外的一類核甘酸化學物質。因為乳酸菌飲料對比別的工業(yè)級菌安全系數(shù)高，故近些年對乳酸菌飲料胞外含糖量的分析也慢慢增加。從現(xiàn)有的分析效果看來，生成EPS的乳酸菌飲料中乳酸菌乳革蘭陰性桿菌生成工作能力較強，為80～600mg/L。胞外含糖量做為食用添加劑，可用于多種多樣食品類的增粘劑、增稠劑、破乳劑和膏劑；具備生物活性如免疫力活力、抗癌和抗?jié)€，可使用于藥業(yè)行業(yè)，相對分子質量大概為4.0×10⁴～6.0×10⁶中間。雖然一直以來學者們對乳酸菌飲料產(chǎn)EPS的有機化學構成存有著矛盾，可是較一致覺得：從乳酸菌飲料中剝離獲得的胞外高聚物是由α-和β-聯(lián)接糖反復模塊所構成的含糖量，而且不一樣乳酸菌飲料代謝的EPS種類不一樣。盡管單糖構成很有可能有一些類似，多見半乳糖、葡萄糖水和鼠李糖，可是各成份比例不一樣。因為提取液中EPS的生產(chǎn)量較低、蛋白質含量較高，給EPS的獲取產(chǎn)生比較大艱難。因而，發(fā)酵物中獲取EPS加工工藝重要就是蛋白的去除與EPS的沉積，可獲得平穩(wěn)、易使用、殘渣少的含糖量商品。本研究對乳酸菌乳革蘭陰性桿菌發(fā)酵物根據(jù)不一樣的標準開展獲取提純EPS，認證最好除蛋白質標準和含糖量沉積標準，為工業(yè)生產(chǎn)乳酸菌飲料胞外含糖量確立理論基礎。

一、原材料與方式

1、原材料與實驗試劑

乳酸菌乳革蘭陰性桿菌乳亞種LL9（下稱乳革蘭陰性桿菌LL9）：鄭州輕工業(yè)學校試驗室給予，由乳酸菌乳革蘭陰性桿菌乳亞種6242（我國的工業(yè)技術微生物菌種菌種保藏管理處（CICC））紫外線誘變，經(jīng)葡萄糖水承受及乳鏈菌肽承受水準挑選挑出來，較為生物活性最后篩選活力高、乳鏈菌肽生產(chǎn)量高的最優(yōu)控制菌種。

分離純化標準為：發(fā)酵物→加上三氯乙酸至2.5%（w/v）→500r/min拌和5min→4℃沉積除蛋白質20min→10000r/s離心式20min除菌體→上清液分析12h→苯酚硫酸法測量EPS?？色@得乳酸菌飲料胞外含糖量的總產(chǎn)量為262.63mg/L。

6%的甲酸水溶液：精準稱量6.0g重蒸酚結晶，用少許的純凈水融解后倒進100mL的容量瓶中，滴定劑、充足混勻，倒進深棕色玻璃燒杯中預留。

2、實驗方法

（1）菌種活化

儲存于凡士林管內乳革蘭陰性桿菌LL9注射于MRS液體培養(yǎng)基內，37℃塑造，傳代2～3次能，上色鏡檢查，選擇優(yōu)質菌種，接轉斜坡塑造，4℃冷藏室儲藏預留。

（2）搖瓶發(fā)醇

活性后菌液5%轉到搖瓶發(fā)醇，37℃控溫150r/min波動塑造24h。

（3）發(fā)酵物解決

取發(fā)醇終點站發(fā)酵物，10000×g下離心式8min除去菌體，取上清液預留。

（4）苯酚硫酸法測量

EPS該辦法較合適乳酸菌飲料EPS檢驗，相對偏差為0.2%，具備不錯的精確性。透析液經(jīng)稀釋液取2.0mL添加1.0mL6.0%的甲酸水溶液，5.0mL95.0%的硫酸，靜放10min，快速震蕩器上震蕩混勻，靜放20min至制冷。490nm測量OD值。標曲上搜索相匹配糖成分，即得乳酸菌飲料胞外含糖量生產(chǎn)量。

（5）獲取提純生產(chǎn)流程

斜坡→MRS液體培養(yǎng)基活性2次（37℃，24h）→搖床擴張塑造（37℃，150r/min，24h）→離心式除去菌體（5mL，10000×g，8min）→加上三氯乙酸50%（w/v）（12h）→500r/min拌和5min→離心式沉積除蛋白質（4℃，18000×g，30min）→上清加酒精沉積含糖量（100%，3倍容積，4℃，解決12h）→離心式（12000×g，30min）→低溫干燥→沉積溫開水融解（稀釋液10倍）→分析MD34（4℃，解決12h）→甲酸-硫酸測定方法OD值→EPS純凈度評定

二、結果與剖析

1、苯酚硫酸法標曲制作

用葡萄糖水做為規(guī)范物，制作標曲。由圖1得知，糖濃度值在0～32mg/L時，糖濃度值和透光性呈線性相關。

2、除蛋白質標準提升

（1）除蛋白質中三氯乙酸濃度值的提升

將發(fā)酵物根據(jù)離心式的辦法去除菌體后，各自添加30%、40%、50%的三氯乙酸水溶液1/5容積，討論不一樣三氯乙酸濃度值對蛋白沉積的危害，如圖2所顯示。三氯乙酸濃度值在30%～50%時與發(fā)酵物含糖量生產(chǎn)量呈正比例關聯(lián)，三氯乙酸濃度值過過高對含糖量的構造造成危害，因而基本明確除蛋白質環(huán)節(jié)三氯乙酸的最佳濃度值為50%。

（2）除蛋白質中向心力提升

本實驗操作中發(fā)酵物體細胞分離出來后，添加50%的三氯乙酸水溶液1/5容積，各自在10000×g、12000×g、13000×g、16000×g向心力下離心式30min，選擇最優(yōu)控制離心式標準，如圖所示3所顯示。在向心力16000×g時，含糖量得率超過最高值，選16000×g為最佳向心力。