1.2.4油茶樹(shù)提取液的配制及5α-R抑止活力的測(cè)量

1.2.4.1不一樣芳烴油荼葉提取液的配制及提取率的測(cè)算

油荼葉除去變病歷經(jīng)選擇，45℃烘干箱干躁，破碎過(guò)60目篩，稱(chēng)量8份20g油荼葉粉末狀按1:40（w:v）料液比各自添加水、50%乙醇溶液、工業(yè)甲醇、酒精、正丁醇、乙酸丁酯、二氯甲烷、乙醚，先拌和泡浸3h再于50℃下超聲波震蕩獲取2次（2h/次），4000r/min離心式10min促使固液分離設(shè)備，上清液轉(zhuǎn)動(dòng)揮發(fā)緩解壓力濃縮去除有機(jī)化學(xué)實(shí)驗(yàn)試劑，隨后真空泵低溫干燥，獲得不一樣極性溶劑的油茶樹(shù)粗提取液各自記作A1-~A8，觀查其色澤及特性，并測(cè)算得率，計(jì)算方法如下所示：

得率%=100×m//M（4）

式中m為提取液的品質(zhì)（g），M為原材料干基品質(zhì)（g）。

1.2.4.2油荼葉提取液5α-R抑止活力的測(cè)量

各自取A1~A8干凍粉末，用50%酒精均配置成200μg/mL的封閉液，依照1.2.2測(cè)量A1-A8封閉液對(duì)5α-R的抑制率，以5α-R抑制率為指標(biāo)值，明確最好制取有機(jī)溶劑，并測(cè)量、測(cè)算最好有機(jī)溶劑提取液對(duì)5α-R活力的半抑止?jié)舛戎担↖C50），有關(guān)計(jì)算方法同公式計(jì)算（3）。

1.2.5油茶樹(shù)提取液總酚和黃酮類(lèi)物質(zhì)成分的測(cè)量

用50%乙醇溶液將A1~A8配置成1mg/mL的封閉液，選用Folin-Ciocalteu法，以沒(méi)食子酸計(jì)，測(cè)量不一樣油荼葉提取液中的總酚成分。標(biāo)曲的制?。号渲锰荻确较驖舛戎档奶J丁水溶液0~50μg/mL。在1mL管理體系中先后添加100μL沒(méi)食子酸水溶液，250μL的福林酚試劑，250μL的15%的碳酸鈉溶液，再補(bǔ)充400μL水至1mL終容積。充足攪拌以后80℃水浴置放30min，靜放制冷10min，4000r/min離心式5min，取上清液于778nm測(cè)量吸光度值A(chǔ)778。根據(jù)沒(méi)食子酸規(guī)范溶液的濃度和相對(duì)應(yīng)的吸光度值制作標(biāo)曲。試品的測(cè)量：實(shí)際操作跟上面一樣，將試品吸光度值帶到標(biāo)曲，以沒(méi)食子酸計(jì)，算得試品總酚成分。

選用亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉溶液著色法，以蘆丁計(jì)，測(cè)量不一樣有機(jī)溶劑植物提取中黃酮類(lèi)物質(zhì)的成分。標(biāo)曲的制?。焊呔芘渲锰荻确较驖舛戎档奶J丁水溶液0~50μg/mL。汲取200μL被測(cè)蘆丁水溶液，放置5mL試管嬰兒中，添加300μL60%乙醇溶液，再添加100μL亞硝酸鈉水溶液，混勻，置放6min，添加150μL硝酸鋁水溶液，混勻，置放6min，添加400μL氫氧化鈉溶液水溶液，最終添加1.35mL60%乙醇溶液至終管理體系為2.5mL，混勻，置放15min，于510nm測(cè)量吸光度值A(chǔ)510。根據(jù)蘆丁規(guī)范溶液的濃度和相對(duì)應(yīng)的吸光度值制作標(biāo)曲。試品的測(cè)量：實(shí)際操作跟上面一樣，將試品吸光度值帶到標(biāo)曲，以蘆丁計(jì)，算得試品黃酮類(lèi)物質(zhì)成分。

1.2.6超高效率液相色譜儀串連三重四極桿航行時(shí)間質(zhì)譜分析（UPLC-TRIPLETOF-MS/MS）剖析評(píng)定油荼葉提取液的有機(jī)化學(xué)成分

參照劉蕾的辦法獲得8mg油荼葉50%酒精提取液，添加2mL工業(yè)甲醇，配置成4mg/mL的提取液待測(cè)液，超聲波5min完用0.22μm微孔濾膜過(guò)慮至高效液相瓶中，被測(cè)。

離子交換柱：C18柱（2.1mm×150mm,1.8μm）；流動(dòng)性相：0.1%苯甲酸-溶液（流動(dòng)性相A）和乙腈（流動(dòng)性相B）；梯度方向過(guò)柱標(biāo)準(zhǔn)：0~10min，5%~13%B；10~20min，13%B；20~40min，13%~20%B；40~60min，20%~45%B；60~70min，45%~100%B；進(jìn)樣量：10µL；流動(dòng)速度：1mL/min；柱溫：35℃；檢驗(yàn)光波長(zhǎng)：280nm。

UPLC-TripleTOF5600 航行時(shí)間液質(zhì)聯(lián)用儀：空氣負(fù)離子逐行掃描；掃描儀范疇：m/z100-2000；做霧化氣（GS1）：55psi；做霧化氣（GS2）：55psi；氣簾氣（CUR）：35psi；離子源溫度（TEM）：550℃（負(fù)）；離子源工作電壓（IS）：-4500V（負(fù)）；一級(jí)掃描儀：去簇工作電壓（DP）：100V；對(duì)焦工作電壓（CE）：10V；二級(jí)掃描儀：應(yīng)用TOFMS-ProductIon-IDA方式收集質(zhì)譜分析數(shù)據(jù)信息，CID動(dòng)能為20、40和60V，氣相前，用CDS泵做品質(zhì)軸校準(zhǔn)，使品質(zhì)軸偏差低于2ppm。

1.3數(shù)據(jù)處理方法

選用EXCEL手機(jī)軟件開(kāi)展數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析（每組數(shù)據(jù)信息均用±s來(lái)表明）；用GraphpadPrism6.0制作曲線圖、柱形圖；相關(guān)分析選用SPSS中Pearson相關(guān)分析統(tǒng)計(jì)分析檢測(cè)（*P＜0.05）。

2結(jié)果與探討

2.15α-R粗酶提取液蛋白質(zhì)成分

粗酶提取液展現(xiàn)淡粉色，選用Bradford法對(duì)5α-R粗酶提取液定量分析，以蛋白質(zhì)含量表明。測(cè)得蛋白標(biāo)曲為y=0.5753x 0.5269（y為吸光度值，x為規(guī)范蛋白質(zhì)濃度值，R2=0.9977），算得濃度值為12.12mg/mL。

2.2T的標(biāo)曲

如圖2所顯示，T在5μmol/L~2000μmol/L范疇內(nèi)展現(xiàn)較好的線性相關(guān)，線性回歸方程為y=18110x 116886（R²=0.9998）。

2.3酶促反應(yīng)管理體系的明確

如圖所示3所顯示，在0~2mmol/L范疇內(nèi)，伴隨著NADPH濃度值的提升，酶促反應(yīng)持續(xù)升高，當(dāng)NADPH濃度值再提升時(shí)對(duì)酶促反應(yīng)的危害并不大，并且充分考慮NADPH價(jià)格比較貴，故最后挑選2mmol/L做為NADPH在5α-R酶促反應(yīng)管理體系中的適合加上濃度值。如圖4所顯示，在0.1~2mmoL范疇內(nèi)，伴隨著T濃度值的提升，酶促反應(yīng)持續(xù)升高，挑選酶促反應(yīng)最大時(shí)相匹配的2mmol/L做為T(mén)在5α-R酶促反應(yīng)管理體系中的適合加上濃度值。如圖所示5所顯示，5α-R提取液濃度值在0.38~0.76mg/mL范疇時(shí)，伴隨著提取液濃度值提升，酶魅力慢慢升高，在含量為0.76mg/mL時(shí)到達(dá)最大值，以后伴隨著提取液濃度值的擴(kuò)大酶魅力反倒減少，因而明確0.76mg/mL為5α-R提取液濃度值在5α-R酶促反應(yīng)管理體系中的適合加上濃度值。

最后確認(rèn)的反映標(biāo)準(zhǔn)以下：pH為7.4的聚磷酸鹽緩沖溶液300μL，加上濃度值為0.76mg/mL的粗酶提取液500μL，加上濃度值為2mmol/L的T50μL，試品50μL,加上濃度值為2mmol/L的NADPH100μL，反映溫度為37℃，反應(yīng)速度為30min。