2結(jié)果與分析

2.1胞壁肽HPLC分析

肽聚糖是由N-乙酰葡糖胺（GlcNAc）、N-乙酰胞壁酸（MurNAc）及肽單元組成的聚合體，肽鏈氨基酸的組成主要是Ala、Glu、DAP，還有極少量的Gly，大多數(shù)G-及產(chǎn)孢菌具有meso-DAP殘基。對枯草芽孢桿菌細胞壁的肽聚糖采用變?nèi)芫孛附猓淦谓?jīng)硼氫化鈉還原后，采用HPLC進行胞壁肽的分離，得到胞壁肽譜圖（圖1）。從圖中可以看出，枯草芽孢桿菌的胞壁肽主要含有15個胞壁肽組分，主要的峰8個。肽聚糖經(jīng)過變?nèi)芫孛附夂?，形成以GlcNAc-MurNAc-L-Ala-D-Glu-mesoDAP為基本結(jié)構(gòu)單元的二聚體、三聚體、四聚體等。這些胞壁肽組分分子質(zhì)量越大，保留時間越長，因此，單體目標(biāo)峰出峰時間較早。Atrih等對枯草芽孢桿菌的胞壁肽進行分析，得到38個組分，在20min保留時間內(nèi)的前4個組分均為胞壁肽單體，個別組分基團出現(xiàn)酰胺化而保留時間不同。此結(jié)果也與文獻報道相一致。
 

2.2胞壁肽ESl-MS分析

對每個組分單峰收集，脫鹽后進行ESI-MS分析，通過對3號峰的MS分析（圖2），其分子離子[M]⁺為m/z869，伴峰：[M+H]⁺為m/z870，該分子質(zhì)量組成與GlcNAc-MurNAc-L-Ala-D-Glu-mesoDAP（理論值：869.9）一致，伴峰的形成是因為在正離子模式下，目的片段會在電離過程中加一個氫，分子質(zhì)量增加。因此，峰3即為目標(biāo)物二糖三肽（GM-ＴriDAP），其結(jié)構(gòu)示意圖如圖2所示。

2.3胞壁肽FTlR

對胞壁肽3號峰單峰收集，冷凍干燥后進行傅里葉變換紅外光譜分析，紅外光譜圖見圖3所示，從圖中可以看出，在2個區(qū)域存在強吸收，一個是～3447cm^-1，另一個是～1020cm^-1。肽鏈的幾個特征帶包括酰胺A帶（～3500cm^-1）、酰胺Ⅰ帶（1600～1700cm^-1）和酰胺Ⅱ帶（1510～1580cm^-1）。酰胺A帶主要是N-H伸縮振動，對氫鍵非常敏感；酰胺Ⅰ帶是肽鏈的主要特征帶，主要是C=O和C-N的伸縮振動；而酰胺Ⅱ帶主要是N-H面內(nèi)變角振動，以及C-N和C-C的伸縮振動。糖環(huán)的特征峰集中在800cm^-1～1200cm^-1之間，包括C-OH的伸縮振動和糖苷鍵C-O-C的振動疊加吸收信號。峰3的紅外光譜的吸收峰歸類見表1所示，從表中可以看出，胞壁肽3號峰包涵糖肽的典型基團振動特征，一個是肽鏈的酰胺吸收帶，包括3447cm^-1的酰胺A帶、1647cm^-1的酰胺Ⅰ帶；另一個是在1200～800cm^-1，1020cm^-1是糖環(huán)以及糖苷鍵的特征吸收峰。因此，胞壁肽3號峰具有典型的糖肽結(jié)構(gòu)特征。
 

2.41HNMR

氫譜是所有核磁共振譜中靈敏度最高的，可以為化合物提供豐富的結(jié)構(gòu)信息。對胞壁肽3號峰的結(jié)構(gòu)進行氫譜分析，檢驗其是否與GlcNAcMurNAc-L-Ala-D-Glu-mesoDAP結(jié)構(gòu)相符。氫譜中各官能團的化學(xué)特性主要體現(xiàn)在化學(xué)位移上，氫原子核外電子云密度越大，化學(xué)位移越小，出峰位置越靠近右方。1HNMR譜見圖4所示，從圖中可以看到典型的胞壁肽信號模式，糖肽官能團本身的性質(zhì)、取代基等都會對物質(zhì)的化學(xué)位移產(chǎn)生影響，從而改變官能團出峰位置，糖環(huán)和肽鏈表現(xiàn)不同的化學(xué)位移。在前人針對肽聚糖片段核磁分析的基礎(chǔ)上，對胞壁肽3號峰氫譜的化學(xué)位移進行歸屬，GlcNAc、MurNAc和肽鏈氨基殘基的典型信號介于4.7×10^-6～3.3×10^-6之間，4.67是GlcNAc異頭碳原子上的質(zhì)子共振信號；對于甲基和脂肪烴的亞甲基質(zhì)子化學(xué)位移介于2.5×10^-6～1.1×10^-6之間。綜合上述分析，胞壁肽峰3的1HNMR與目標(biāo)糖肽結(jié)構(gòu)相符。

2.5胞壁肽對芽孢萌發(fā)的影響

芽孢萌發(fā)后熱抗性消失，濕熱處理（80℃，20min）不能直接殺滅芽孢，但可將萌發(fā)的芽孢殺滅。因此，熱抗性消失經(jīng)常用來表征芽孢是否經(jīng)歷了萌發(fā)。為驗證本文中得到的胞壁肽是否具有萌發(fā)效果，將制備的胞壁肽加入到枯草芽孢桿菌168芽孢液中混合均勻（胞壁肽終質(zhì)量濃度為1mg/mL），37℃振蕩孵育1h。隨后，將胞壁肽處理后的芽孢進行濕熱處理（80℃，20min），利用平板計數(shù)法計算濕熱處理前后芽孢數(shù)量的變化即為萌發(fā)芽孢的數(shù)量。胞壁肽對枯草芽孢桿菌168芽孢萌發(fā)的影響如圖5所示。未加入胞壁肽的處理組中，芽孢數(shù)經(jīng)濕熱處理后并未減少，說明芽孢仍保持原有的熱抗性，并未發(fā)生萌發(fā)過程。而加入胞壁肽后的芽孢經(jīng)濕熱處理后數(shù)量減少了0.9個對數(shù)，說明0.9個對數(shù)的芽孢在胞壁肽處理后熱抗性消失，發(fā)生了萌發(fā)，與前人研究結(jié)果相一致。由此可知，本試驗中制備的胞壁肽（二糖三肽）能誘導(dǎo)芽孢萌發(fā)，為后續(xù)進一步研究胞壁肽誘導(dǎo)芽孢萌發(fā)機理奠定基礎(chǔ)。
 

3結(jié)論

利用枯草芽孢桿菌為對象，制備、分離純化細菌營養(yǎng)體細胞壁上的胞壁肽，得到的胞壁肽最小單位為二糖三肽，此胞壁肽可以有效促進芽孢萌發(fā)，為芽孢萌發(fā)的進一步研究奠定基礎(chǔ)。