時(shí)間分辨熒光免疫分析技術(shù)(time-resolvedfluoroimmunoassay,TRFIA)是依賴(lài)于稀土元素獨(dú)特的熒光性質(zhì)而發(fā)展起來(lái)的一種免疫檢測(cè)技術(shù)，它集合了放射免疫技術(shù)、酶聯(lián)免疫技術(shù)以及普通熒光免疫技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性好，且線性范圍寬，熒光壽命長(zhǎng)，操作簡(jiǎn)單和非放射性等特點(diǎn)，在免疫分析領(lǐng)域展現(xiàn)了良好的應(yīng)用前景。圍繞時(shí)間分辨熒光在免疫分析中的最新研究進(jìn)展，介紹了幾種常見(jiàn)的用于TRFIA的材料，闡述了TRFIA在免疫診斷、食品檢測(cè)、環(huán)境監(jiān)測(cè)等方面的應(yīng)用，并對(duì)其發(fā)展方向和應(yīng)用前景進(jìn)行了展望。

時(shí)間分辨熒光免疫分析技術(shù)(time-resolvedfluoroimmunoassay,TRFIA)是將時(shí)間分辨熒光與免疫分析技術(shù)相結(jié)合，依賴(lài)于稀土元素熒光壽命長(zhǎng)、Stokes位移大、發(fā)射光譜信號(hào)峰尖銳等獨(dú)特的熒光性質(zhì)而發(fā)展起來(lái)的一種檢測(cè)技術(shù)，其基本過(guò)程是首先利用稀土元素標(biāo)記抗原或抗體，在一定的體系中與待測(cè)物反應(yīng)形成免疫復(fù)合物；然后通過(guò)設(shè)定適當(dāng)?shù)难舆t時(shí)間和門(mén)控時(shí)間，脈沖激發(fā)待測(cè)產(chǎn)物，短壽命的背景熒光信號(hào)(納秒級(jí)別內(nèi))會(huì)在延遲時(shí)間內(nèi)衰減消失，再對(duì)熒光信號(hào)進(jìn)行采集，得到長(zhǎng)熒光壽命的信號(hào)信息；最后根據(jù)相對(duì)熒光強(qiáng)度對(duì)待測(cè)物進(jìn)行定量分析。該方法能夠消除本底短壽命熒光的干擾，提高了檢測(cè)信噪比，與傳統(tǒng)的熒光檢測(cè)技術(shù)相比，明顯提高了熒光檢測(cè)結(jié)果的靈敏度和準(zhǔn)確度。

研究從TRFIA的材料和應(yīng)用兩個(gè)方面對(duì)其進(jìn)行闡述，列舉了幾種常見(jiàn)的用于TRFIA的材料及其制備方法的改進(jìn)，并且對(duì)TRFIA在免疫診斷、食品檢測(cè)、環(huán)境監(jiān)測(cè)等領(lǐng)域的應(yīng)用進(jìn)行了介紹。

1用于TRFIA的材料

1.1稀土螯合物

稀土離子本身的發(fā)光效率較低，引入適當(dāng)?shù)挠袡C(jī)配體與稀土離子配位，利用分子內(nèi)的能量轉(zhuǎn)移，敏化中心離子發(fā)光，可以有效增強(qiáng)稀土離子的熒光性質(zhì)。選擇合適的功能基團(tuán)和設(shè)計(jì)適當(dāng)?shù)呐潴w，使得稀土元素與抗原抗體形成穩(wěn)定的熒光復(fù)合物，可以用于時(shí)間分辨熒光免疫分析。常用的稀土螯合劑主要包括多氨基羧酸類(lèi)、β-二酮類(lèi)、菲啰啉類(lèi)、水楊酸類(lèi)以及聯(lián)吡啶類(lèi)螯合劑。

多氨基羧酸類(lèi)螯合劑包括乙二胺四乙酸(EDTA)、二乙三胺四乙酸(DTTA)和二乙三胺五乙酸(DTPA),主要用于解離-增強(qiáng)鑭系熒光免疫分析系統(tǒng)(DELFIA)。此類(lèi)螯合劑與稀土離子螯合的能力很強(qiáng)，具有穩(wěn)定性好、在酸性增強(qiáng)液中稀土離子解離快的優(yōu)點(diǎn)，這樣有利于提高分析方法的靈敏度。

β-二酮類(lèi)螯合劑包括β-NTA、2-噻吩甲?；?TTA)和三甲基乙酰三氟丙酮(PTA),它們能與稀土離子形成熒光很強(qiáng)的配合物，但是這些二齒配位體上沒(méi)有可與抗原(抗體)結(jié)合的功能性取代基，并且形成的配合物穩(wěn)定性較差，不能直接作為標(biāo)記物進(jìn)行時(shí)間分辨熒光分析。因此，有課題組設(shè)計(jì)合成一種氯磺?；乃凝Xβ-二酮，用作稀土離子螯合劑。

此外，4,7-二(氯磺酰基苯基)-1,10-菲啰啉-2,9-二羧酸(BCPDA)是典型的菲啰啉衍生物，主要用于CyberFluoro體系，它的特點(diǎn)是可以與Eu3+配位發(fā)出長(zhǎng)壽命的熒光，無(wú)需加入熒光增強(qiáng)溶液便可直接測(cè)定熒光強(qiáng)度，但是BCPDA-Eu3+在時(shí)間分辨熒光免疫分析中存在靈敏度較低的缺點(diǎn)，通過(guò)引入生物素-鏈霉親和素系統(tǒng)(BAS),使得檢測(cè)靈敏度得到顯著提高。

1.2稀土摻雜納米材料

隨著納米材料和納米技術(shù)在醫(yī)學(xué)、生物傳感、環(huán)境科學(xué)等領(lǐng)域的迅速發(fā)展，稀土離子摻雜的納米顆粒作為一種光致發(fā)光納米材料，以其獨(dú)特的熒光性能引起了人們的普遍關(guān)注。稀土摻雜的納米晶體在熒光性能優(yōu)越和熒光壽命長(zhǎng)的基礎(chǔ)上，具有量子產(chǎn)率高、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，代替稀土螯合物材料成為新一代熒光納米探針。

目前，用于制備稀土摻雜納米顆粒的方法主要包括水(溶劑)熱合成法、熱分解法、共沉淀法等。絕大部分方法是在親油性表面活性劑以及其它高沸點(diǎn)的有機(jī)溶劑中制備稀土摻雜納米顆粒的，這將有利于合成尺寸分布范圍窄、結(jié)晶程度好、核殼結(jié)構(gòu)明確、光學(xué)性能優(yōu)異的高質(zhì)量納米顆粒，但該種材料疏水性，不易與生物體系相容。為了使其適用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，需要對(duì)納米粒子進(jìn)行表面修飾和功能化，增加疏水性稀土摻雜納米顆粒的親水性。

研究表明，通過(guò)二氧化硅包覆、配體交換、配體氧化、配體吸引、層層自組裝以及配體剝離等幾種表面修飾方法，如圖2所示，可以制備具有良好生物相容性的親水性納米材料，從而進(jìn)一步拓寬TRFIA的應(yīng)用領(lǐng)域。

1.3其他材料

量子點(diǎn)(quantumdots,QDs)是一種尺寸約為1～10nm的光致發(fā)光半導(dǎo)體納米晶體，具有激發(fā)光譜寬且連續(xù)分布、發(fā)射光譜窄而對(duì)稱(chēng)、斯托克斯位移較大、光化學(xué)穩(wěn)定性高、熒光壽命長(zhǎng)等優(yōu)越的熒光特性，是一種理想的熒光探針。Chen等開(kāi)發(fā)了一種基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)的均相時(shí)間分辨熒光免疫分析定量檢測(cè)癌胚抗原(CEA)的方法，將成功制備的鋱螯合物和谷胱甘肽修飾的硒化鎘/硫化鋅(CdSe/ZnS)量子點(diǎn)分別與不同的抗CEA單克隆抗體(McAb)結(jié)合，在雙抗體夾心模式下，利用時(shí)間分辨熒光檢測(cè)儀在量子點(diǎn)發(fā)射峰(565nm)外檢測(cè)到與CEA濃度成正比的熒光強(qiáng)度，并與CEA濃度成正比。該方法操作簡(jiǎn)便、耗時(shí)較短、靈敏度高，制備的水溶性量子點(diǎn)的光學(xué)性質(zhì)適合于均相免疫分析，作為一種熒光材料，可以進(jìn)一步應(yīng)用于臨床檢測(cè)。

含稀土配合物的熒光聚合物微球結(jié)合微球的比表面積大、表面易功能化優(yōu)點(diǎn)和稀土配合物極寬的斯托克斯位移和超長(zhǎng)熒光壽命(約0.5ms)的特性，在時(shí)間分辨熒光分析方面也得到了很好的應(yīng)用。

2TRFIA在免疫分析中的應(yīng)用

2.1TRFIA在免疫診斷中的應(yīng)用

免疫診斷是應(yīng)用免疫學(xué)的理論、技術(shù)和方法診斷各種疾病以及測(cè)定免疫狀態(tài)，常用技術(shù)包括放射免疫、酶聯(lián)免疫、化學(xué)發(fā)光等。TRFIA憑借其靈敏度高、特異性強(qiáng)、簡(jiǎn)便、快速的優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于傳染病診斷、腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)以及其它臨床疾病的診斷(表1)。