朝鮮薊為菊科菜薊屬多年生長 木本植物，關(guān)鍵栽植于地中海地區(qū)，始于天然的多年生長的野生型刺菜薊，是一種含有營養(yǎng)元素的養(yǎng)生蔬菜水果，被覺得是一種功能食品，具備減輕肝膽病及消化不好、抗氧化性、抑菌、防癌等多種多樣生理作用活力。朝鮮薊的可食用部份為內(nèi)部苞片及花托，不能服用的工業(yè)生產(chǎn)副產(chǎn)品一部分包含其外界苞片及葉莖，占全部主莖生物量的80％上下，導(dǎo)致很多的農(nóng)田占有、資源消耗及空氣污染，因而對朝鮮薊葉莖副產(chǎn)品的綜合利用至關(guān)重要。

三萜類是異戊二烯高聚物以及化合物的統(tǒng)稱，而倍半萜化學(xué)物質(zhì)及三萜化學(xué)物質(zhì)是朝鮮薊中首要的親脂質(zhì)化學(xué)物質(zhì)。Ramos等從刺菜薊中獲取了脂溶性成份并對其成分開展結(jié)構(gòu)化分析，在其中去?；怂E苦素、羽扇豆醇冰醋酸酯、ψ-蒲公英花谷甾醇冰醋酸酯在種植型刺菜薊中均為第1次報導(dǎo)。有參考文獻(xiàn)說明，三萜類具備抗血脂高圈、抗感染嘲、防癌同樣生理學(xué)活力，殊不知目前為止，對朝鮮薊副產(chǎn)品中三萜類的綜合利用及有關(guān)活力的分析較少，針對其神經(jīng)系統(tǒng)維護(hù)功能的消息也是不夠。
很多研究表明，氧化應(yīng)激誘發(fā)的神經(jīng)元損害與多種多樣神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病相關(guān)，如阿爾茲海默癥和帕金森等。在神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病中，臭氧造成的氧化應(yīng)激被普遍以為是神經(jīng)元細(xì)胞損害的首要緣由之一。現(xiàn)廣泛認(rèn)為，對神經(jīng)中樞系統(tǒng)軟件衰退的合理治療方法是維護(hù)神經(jīng)元免遭空氣氧化損害。有大量的科學(xué)研究證實，很多純天然黃酮類物質(zhì)都具備神經(jīng)系統(tǒng)維護(hù)功效。

本探討選用GC-MS剖析朝鮮薊副產(chǎn)品脂溶性提取液中萜類及谷甾醇類物質(zhì)的構(gòu)成與成分，根據(jù)測量不一樣指標(biāo)值科學(xué)研究脂溶性提取液對神經(jīng)元細(xì)胞的保障功效，為朝鮮薊副產(chǎn)品的開發(fā)給予參照。

1 原材料與方式

1.1 原材料與實驗試劑

朝鮮薊的葉莖等副產(chǎn)品于2018年4月份采自于我國云南曲靖市陸良縣神經(jīng)中樞鎮(zhèn)華僑農(nóng)場，采摘后當(dāng)日馬上國際空運送到試驗室，液氮冷凍治療干躁、破碎，過50目篩，裝于包裝袋中，于-20℃冰柜中儲存。

正構(gòu)乙烷(C7～C40)，上海市安普試驗科技發(fā)展有限責(zé)任公司；正十六烷(純凈度>99.5％)、吡啶(純凈度>99.9％)，上海市阿拉丁生物化學(xué)科技發(fā)展有限責(zé)任公司；菜薊苦素(純凈度96.4％)、豆谷甾醇(純凈度98％)、β-谷甾醇(純凈度95％)、羽扇豆醇(純凈度98％)，天津市阿爾塔高新科技有限責(zé)任公司；α-香環(huán)氧樹脂醇(純凈度≥98％)、β-香環(huán)氧樹脂醇(純凈度≥98％)、AnnexinV-FITC細(xì)胞凋亡診斷試劑盒，英國Sigma-A1drich企業(yè)；三甲基氯硅烷(純凈度>99％)、N，0-雙(三羥基硅烷基)三氟乙酰胺(純凈度96％)、二氯甲烷(分析純級)，上海市麥克林生物化學(xué)高新科技有限責(zé)任公司；30％H202水溶液，國藥控股有機化學(xué)有限責(zé)任公司；RPMll640培養(yǎng)液、青霉素鈉-氨芐青霉素、0.25％蛋白酶，英國GIBCO企業(yè)；胎牛血清，英國HYCLONE企業(yè)；二甲基亞砜(DMSO)、PBS緩沖溶液、DPBS緩沖溶液、CCK8檢測試劑盒、DCFH-DA檢測試劑盒、吖啶橙-溴化乙錠(A0-EB)檢測試劑盒，索萊寶生物技術(shù)有限責(zé)任公司；脂類空氣氧化(MDA)檢測試劑盒、乳酸脫氫酶細(xì)胞毒性診斷試劑盒，碧云天生物技術(shù)性有限責(zé)任公司。

1.2 關(guān)鍵儀器設(shè)備與機器設(shè)備

6890N/5973氣象色譜儀-質(zhì)譜分析液質(zhì)儀，英國安捷倫科技企業(yè)：BDFACSEALIBUR型流式細(xì)胞儀，英國BD企業(yè)：YG-XD30型光學(xué)顯微鏡，我國PVD企業(yè)；Tis型顛倒相差顯微鏡，日本Nikon企業(yè)：InfiniteF50型酶標(biāo)儀。澳洲TECAN企業(yè)。

1.3 脂溶性物質(zhì)的獲取

參照Romas等的辦法并稍加改動。精確稱量朝鮮薊副產(chǎn)品干凍粉5g，添加125mL二氯甲烷，索氏提取7h。運用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器在50℃下對萃取液開展低電壓干躁，旋蒸后添加二氯甲烷對干躁后的提取液開展復(fù)溶，滴定劑至25mL，取1mL氮吹至完全干躁，于-20℃冰柜中儲存。

1.4 GC-MS剖析

參照Romas等的辦法并稍加改動。在開展GC-MS檢驗以前，先開展三羥基氯硅烷化(TMS)衍化，向氮吹干躁后的脂溶性提取液中添加250μL含1mg正十六烷(內(nèi)標(biāo))的吡啶，待提取液充分分解后，添加250μL的N，O-雙(三羥基硅烷基)-三氟乙酰胺和50μL的三甲基氯硅烷，混合物質(zhì)于70℃反映30min。

氣象色譜儀-質(zhì)譜分析液質(zhì)儀配上DB-5J&W毛細(xì)管柱(30m×0.25mm×0.25μm，英國安捷倫科技企業(yè))，載氣為高純氦氣(41cm/s)。色譜儀的使用標(biāo)準(zhǔn)為：自動進(jìn)樣，進(jìn)樣量1μL，氣相口溫度270℃，分離比30:1。柱溫箱的加熱程序流程為：原始溫度120℃，維持2min，以4℃/min的速率升到250℃，然后以2℃/min的速率升到285℃，并維持15min。質(zhì)譜分析的使用標(biāo)準(zhǔn)為：正離子撞擊方式，正離子動能70eV，以全逐行掃描開展數(shù)據(jù)采集。掃描儀區(qū)域為，以30～600，離子源溫度230℃。
GC-MS色譜圖的圖像處理軟件選用MSDChem-Station工作平臺(Agilent，VersionE02)。判定時，根據(jù)將色譜儀峰的質(zhì)譜分析信息內(nèi)容與相關(guān)的資料及工作平臺所搭配的NIST質(zhì)譜分析庫實現(xiàn)較為，必需時根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品判定。定量分析時，關(guān)鍵的萜類及谷甾醇類物質(zhì)根據(jù)標(biāo)曲定量分析。其他化學(xué)物質(zhì)根據(jù)內(nèi)標(biāo)(正十六烷)定量分析，結(jié)果均換算為試品中化學(xué)物質(zhì)的成分，用mg/kgDM表明。

1.5 細(xì)胞培養(yǎng)基

參照Tang等的辦法并稍加改動。將PCI2體細(xì)胞用完全培養(yǎng)基(RPMI1640培養(yǎng)液，10％胎牛血清，1％青霉素鈉-氨芐青霉素)注射于6填料中，注射相對密度3×10五個/mL。接種量2mL/孔，放置37℃，5％CO2的水冷器式CO2孵育箱中塑造24h。

1.6 體細(xì)胞魅力的測量

將PCI2體細(xì)胞用完全培養(yǎng)基注射于96孔板中，注射相對密度3×10五個/mL，接種量100μL/孔，于37℃，5％C02的孵育箱中塑造24h。用不完全培養(yǎng)基(RPMI1640培養(yǎng)液，2％胎牛血清，1％青霉素鈉-氨芐青霉素)將脂溶性提取液稀釋液無上、中、低3個不一樣的濃度值，各自解決PC12體細(xì)胞8h后。添加含90μmol/LH202的不完全培養(yǎng)基塑造4h。與預(yù)維護(hù)后損害組相對性應(yīng)，以沒經(jīng)脂溶性提取液維護(hù)、經(jīng)H202損害的PCI2體細(xì)胞做為實體模型組，以沒經(jīng)H2O2損害、經(jīng)濃度較高的脂溶性提取液解決的PCI2體細(xì)胞做為脂溶性提取液維護(hù)組。以沒經(jīng)其他解決的PC12體細(xì)胞做為空白試驗組，運用CCK8法檢驗每孔中體細(xì)胞的成活率，參照Ding等圈的方式 ，將解決后的體細(xì)胞清除培養(yǎng)液，添加100μL/孔調(diào)好的CCK8切削液，放置5％CO2的孵育箱中，37℃孵育2h。酶標(biāo)儀檢驗橘黃甲臌的總產(chǎn)量。檢驗光波長450nm處的OD值值，每一組做6個平行面。

1.7 乳酸脫氫酶(LDH)露出率檢驗

細(xì)胞培養(yǎng)基中的LDH成分是考量體細(xì)胞受損水平的主要指標(biāo)值，對依照1.5節(jié)方式塑造好的體細(xì)胞開展4組不一樣解決后，搜集每孔中的培養(yǎng)液，依照檢測試劑盒使用說明檢驗培養(yǎng)液中LDH活力。

1.8 抗氧化性活力的測量

氧化應(yīng)激會立即或間接性造成ROS受體的核苷酸、蛋白和脂類損害，而且涉及到病變圜、神經(jīng)系統(tǒng)退行性改變幽、主動脈粥樣硬化、糖尿病患者圓和變老陶等。在神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病中，臭氧(ROS)造成的氧化應(yīng)激被普遍以為是神經(jīng)元細(xì)胞損害的首要緣由之一，本科學(xué)研究運用2’，7’-二氯熒光黃雙甲酸鹽(DCFH-DA)探頭檢驗體細(xì)胞內(nèi)ROS水準(zhǔn)。對依照1.5節(jié)方式塑造好的體細(xì)胞開展脂溶性提取液解決組、實體模型組、空白試驗組3組解決后，用沒有乙二胺四乙酸(EDTA)的蛋白酶消化吸收體細(xì)胞，于4℃，1500r/min離心式3min后應(yīng)用完全培養(yǎng)基清洗體細(xì)胞，依照1:1000占比用無血清蛋白培養(yǎng)液(RPMll640培養(yǎng)液，1％青霉素鈉-氨芐青霉素)稀釋液DCFH-DA。取0.5mL封閉液添加體細(xì)胞，于CO2孵育箱中遮光孵育20min，應(yīng)用無血清蛋白培養(yǎng)液清洗體細(xì)胞3次，用光學(xué)顯微鏡觀查體細(xì)胞瑩光狀況，并且用流式細(xì)胞儀量化分析檢驗。檢驗標(biāo)準(zhǔn)為激起光波長488nm。發(fā)送光波長605nm。對依照1.5節(jié)方式塑造好的體細(xì)胞開展4組解決后，依照檢測試劑盒使用說明對人體細(xì)胞內(nèi)丙二醛(MDA)水準(zhǔn)開展檢驗，來明確脂類空氣氧化的水準(zhǔn)。

1.9 細(xì)胞壞死的測量

對依照1.5節(jié)方式塑造好的體細(xì)胞開展預(yù)維護(hù)后損害組、實體模型組、空白試驗組3組解決后，用沒有EDTA的蛋白酶消化吸收搜集體細(xì)胞。杜氏磷酸緩沖液(DPBS)清洗體細(xì)胞2次，添加500μL雙蒸水稀釋液好的融合緩沖溶液(1×)重懸體細(xì)胞，上機操作前添加5μL膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素(AnnexinV-FITC)和10μL碘化丙啶(PI)，室內(nèi)溫度遮光反映10min，體細(xì)胞流式的儀量化分析檢驗，檢驗標(biāo)準(zhǔn)為激起光波長488nm，發(fā)送光波長530nm。對依照1.5節(jié)方式塑造好的體細(xì)胞開展預(yù)維護(hù)后損害組、實體模型組、空白試驗組3組解決后，向每一個體細(xì)胞解決組的培養(yǎng)液中添加40μLA0-EB染色液，室內(nèi)溫度置放5min，光學(xué)顯微鏡照相觀查。