芽胞是病菌在自然環(huán)境威逼（如超低溫、旱災(zāi)和營(yíng)養(yǎng)成分欠缺等）下產(chǎn)生的休眠狀態(tài)體。因其特有的構(gòu)造特點(diǎn)而對(duì)高溫、髙壓、干躁、輻射源、超低溫、腐蝕成分等具備較強(qiáng)的抵抗性。如何把芽胞消滅一直是食品殺菌行業(yè)亟需攻克的至關(guān)重要的問(wèn)題。目前消滅芽胞主要是靠傳統(tǒng)式的高溫、髙壓的方式 ，殊不知高溫、髙壓在消滅芽胞的與此同時(shí)，也會(huì)造成營(yíng)養(yǎng)食品外流，口味、口味等質(zhì)量的明顯降低。怎樣在常溫狀態(tài)消滅芽胞一直是食品類行業(yè)科研工作人員的一大挑戰(zhàn)。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)芽胞出芽后，其抵抗性消退，這也為消滅芽胞給予了一個(gè)合理對(duì)策?，F(xiàn)如今，先出芽后消滅是消滅芽胞的一個(gè)最重要途徑。

肽聚糖是細(xì)菌細(xì)胞壁的主要成分，由N-乙酰葡萄糖胺（GlcNAc）和N-乙酰胞壁酸（MurNac）根據(jù)β-1，4糖苷鍵聯(lián)接匯聚而成。與MurNac相接的先后是L-Ala，γ-Glu，m-Dpm和D-Ala。革蘭氏陽(yáng)性菌陰性菌和陽(yáng)性菌的關(guān)鍵差異在第三個(gè)碳水化合物，大部分陽(yáng)性菌的第三個(gè)碳水化合物是L-Lys。胞壁肽是肽聚糖酶解后物質(zhì)。研究表明，帶有Dpm的胞壁肽是一種合理的出芽劑，能推動(dòng)芽胞出芽。最少的合理結(jié)構(gòu)單元的胞壁肽為二糖三肽，其二聚體或三聚體仍然能誘發(fā)芽胞出芽。目前，中國(guó)都還沒(méi)有關(guān)胞壁肽分離純化的報(bào)導(dǎo)，都沒(méi)有有關(guān)胞壁肽對(duì)芽胞出芽的危害科學(xué)研究。文中根據(jù)酶解等方式取得成功分離純化了胞壁肽，科學(xué)研究胞壁肽針對(duì)芽胞出芽的危害，為后期科學(xué)研究打下基礎(chǔ)。

1原材料與方式

1.1實(shí)驗(yàn)原材料

枯草枯草芽孢菌（Bacillus.subtilis168），購(gòu)自我國(guó)的工業(yè)技術(shù)微生物菌種菌種保藏管理處（CICC）。

1.2實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)試劑

LB液體培養(yǎng)基，北京索萊寶高新科技有限責(zé)任公司；BacterialAgar（BD）；α-胃蛋白酶、蛋白酶、變?nèi)芫?，選購(gòu)自英國(guó)Sigma企業(yè)；其他實(shí)驗(yàn)試劑均為分析純。

1.3儀器設(shè)備及機(jī)器設(shè)備

顛倒光學(xué)顯微鏡，德國(guó)蔡司企業(yè)；高效率液相色譜儀，日本安捷倫儀器企業(yè)；超高效液相色譜-質(zhì)譜分析液質(zhì)儀，英國(guó)沃特世企業(yè)；電加熱恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒高新科技有限責(zé)任公司；傅里葉變換紅外光譜分析掃描機(jī)，英國(guó)珀金埃爾默企業(yè)；500兆磁共振譜儀，法國(guó)布魯克企業(yè)；工作壓力蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠；多用途酶標(biāo)儀，法國(guó)帝肯企業(yè)；勻質(zhì)粉碎儀，英國(guó)Fastprep24；冷凍離心機(jī)，日本日立企業(yè)。

1.4實(shí)驗(yàn)方式

1.4.1枯草枯草芽孢菌芽胞的制取

菌苗首先用LB瓊脂粉培養(yǎng)液活性3代之上，連接2×SG培養(yǎng)液中涂板塑造。在37℃塑造2d后，用相差顯微鏡鏡檢查芽胞，當(dāng)視線中絕大多數(shù)芽胞從纖維細(xì)胞中掉下來(lái)后，用冷的無(wú)菌檢測(cè)雙蒸水將培養(yǎng)液上的芽胞清理搜集到離心管架中，離心式標(biāo)準(zhǔn)為8000g、4℃、10min，離心式多次。離心式歷程中確保全過(guò)程在低溫標(biāo)準(zhǔn)中開(kāi)展。離心式后去除上清液，得到的芽胞沉積重懸在ACES緩沖溶液（0.05mol/L，pH7.0）中，最終用相差顯微鏡鏡檢查，視線中≥95%的芽胞展現(xiàn)光亮狀即可應(yīng)用。芽胞濃度值約為1.0×10⁸CFU/mL，儲(chǔ)放于4℃電冰箱，一個(gè)月內(nèi)應(yīng)用。

1.4.2芽胞平板電腦記數(shù)

將芽胞混液開(kāi)展梯度方向稀釋液，枯草枯草芽孢菌芽胞選用營(yíng)養(yǎng)成分瓊脂粉培養(yǎng)液開(kāi)展竭盡平板電腦記數(shù)，每一個(gè)平板電腦中添加1mL稀釋液菌液?？莶菘莶菅挎呔堪?7℃標(biāo)準(zhǔn)下開(kāi)展塑造，塑造24h。除菌實(shí)際效果用芽胞降低的多數(shù)表明：lg（Nt/N0），在其中，Nt為解決后生存的菌體數(shù)，N0為解決前菌落總數(shù)。

1.4.3芽胞出芽實(shí)驗(yàn)

汲取適當(dāng)芽胞液于離心管架中，添加適量出芽劑。置放在搖床中塑造1h（37℃，200r/min）。以后將芽胞液放進(jìn)80℃水浴中加溫20min。平板電腦記數(shù)測(cè)算芽胞出芽率。

1.4.4肽聚糖的獲取

選用枯草枯草芽孢菌（Bacillussubtilis168）的植物細(xì)胞獲取肽聚糖。選購(gòu)的菌苗在液體培養(yǎng)基中活性3代后應(yīng)用。將枯草枯草芽孢菌注射到LB瓊脂粉培養(yǎng)液上，于37℃塑造24h。取新鮮單菌體注射到適當(dāng)?shù)腖B液體培養(yǎng)基中塑造至OD600約1.0，離心式搜集菌體（8000×g、4℃、10min），用冷的無(wú)菌檢測(cè)雙蒸水清理2次。將沉積再次飄浮于8%SDS水溶液中，燒開(kāi)30min，離心式（13000×g，15min，25℃）搜集沉積，清理多次直到去除殘存的SDS。SDS解決去除了菌體的其他蛋白，非共價(jià)鍵融合的蛋白和脂多糖。將沉積溶解無(wú)菌檢測(cè)雙蒸水中勻質(zhì)粉碎儀粉碎病菌，不可溶植物細(xì)胞成分再根據(jù)離心式搜集（40000×g，30min，25℃）。搜集的不可溶植物細(xì)胞進(jìn)一步用α-胃蛋白酶、蛋白酶開(kāi)展酶解，以去除植物細(xì)胞上的糖元、共價(jià)鍵融合的蛋白。之上二步酶解均在緩沖溶液中開(kāi)展（10mmol/LＴris-HCl，pH8.0），在蛋白酶中必須添加10mmol/LCaCl2。將酶解液添加SDS（終質(zhì)量濃度1%）燒開(kāi)鈍化處理蛋白酶，并清理去除SDS。將植物細(xì)胞再次飄浮于鹽酸（5mg細(xì)胞壁飄浮于2mL48%HF）中，4℃解決48h。HF能夠去除肽聚糖上磷酸二酯鍵共價(jià)鍵聯(lián)接的次生植物細(xì)胞含糖量，包含磷壁酸、poly-（β，1-6GlcNAc）等。植物細(xì)胞成分再各自選用8mol/LLiCl和0.1mol/LEDＴA清理，無(wú)菌水清理2次，最終選用甲苯去除脂磷壁酸和脂多糖。將試品干凍，獲得肽聚糖。

1.4.5胞壁肽分離純化

將獲取的肽聚糖飄浮于12.5mmol/L聚磷酸鹽緩沖溶液（1mmol/LMgCl2，pH6.0，0.02%疊氮化鈉）中，添加5μg/mL變?nèi)芫?，?7℃酶解24h。酶解的胞壁肽必須選用硼氫化鈉復(fù)原，避免Cl的異構(gòu)化。將胞壁肽飄浮于100mL0.5mol/L的硼酸鹽緩沖溶液（pH9.0）中。胞壁肽復(fù)原選用新鮮配置的25mL，25mg/mLNaBH4，在添加全過(guò)程使得pH維持在9.0。氧化反應(yīng)在室內(nèi)溫度中維持15min并不斷地震蕩，添加H3PO4使反映停止，將pH調(diào)為4。所得的試品儲(chǔ)存在-20℃。復(fù)原的胞壁肽選用HPLC（Shimadzu）分離出來(lái)，ODS色譜柱（Hypersiloctadecylsilanecolumn，250mm×4.6mm，顆粒物：5μm，30105-254630，ＴhermoFisherScientific）。過(guò)柱液分別是：A，40mmol/L倍他米松（pH4.5）；B，40mmol/L倍他米松（pH4.0）并添加20%（摩爾分?jǐn)?shù)）工業(yè)甲醇。A、B流動(dòng)性看中添加0.00025%的疊氮化鈉。離子交換柱均衡柱頭選用流動(dòng)性相A，柱溫52℃，流動(dòng)速度0.5mL/min，均衡1h。可溶胞壁肽氣相100μL，氣相5min后，過(guò)柱程序流程為B流動(dòng)性相以線形梯度方向從0到100%，時(shí)間為5min到270min，流動(dòng)性相流動(dòng)速度維持在0.5mL/min。胞壁肽成分檢驗(yàn)選用紫外線探測(cè)器，光波長(zhǎng)為206nm

1.4.6胞壁肽成分除鹽

胞壁肽成分干凍后再次飄浮于無(wú)菌檢測(cè)超純水系統(tǒng)中，選用HPLC法開(kāi)展除鹽，離子交換柱為上述情況分離出來(lái)柱。柱頭選用0.007%（摩爾分?jǐn)?shù)）三氟乙酸均衡，柱溫35℃，流動(dòng)速度1mL/min，胞壁肽選用50%工業(yè)甲醇（0.0025%三氟乙酸）線形梯度方向（0～100%）過(guò)柱，過(guò)柱時(shí)間在30～50min中間，胞壁肽成分檢驗(yàn)選用紫外線探測(cè)器，光波長(zhǎng)為206nm。

1.4.7三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜評(píng)定

除鹽的胞壁肽成分選用三重四級(jí)桿串連質(zhì)譜儀器（QuattroMicro，Micromass）開(kāi)展評(píng)定。全逐行掃描（MSScan）質(zhì)譜分析標(biāo)準(zhǔn)：共價(jià)鍵（ESI ）數(shù)據(jù)收集方式造成準(zhǔn)分子離子峰[M H] ；m/z掃描儀范疇100～2000u；毛細(xì)血管工作電壓3.5kＶ；錐孔工作電壓40Ｖ；提純工作電壓5.0Ｖ；離子源溫度110℃；脫有機(jī)溶劑溫度450℃；脫有機(jī)溶劑氣650L/h；錐孔反吹氣檢查50L/h；RF鏡片工作電壓0.5Ｖ。

1.4.8紅外掃描光譜儀

選用壓片糖果法將1.5mg干凍的GM-ＴriDAP與200mg干躁的KBr在瑪瑙研缽中混和碾磨勻稱，放置模具中，用粉末壓片機(jī)完成壓片糖果（工作壓力為20～30MPa）1min，取出后獲得全透明的試品片狀，用傅里葉變換紅外線譜儀開(kāi)展紅外光譜分析的掃描儀，掃描儀范疇4000～500cm^-1。

1.4.91HNMR

將2mg干凍的GM-ＴriDAP試品溶解1mLD2O中，低溫干燥并反復(fù)3次將糖肽中的開(kāi)朗H換置，溶解0.5mLD2O之后放置核磁管中，磁共振剖析選用500兆磁共振譜儀，室內(nèi)溫度20℃，500MHz作氫譜。

1.5數(shù)據(jù)分析與剖析

全部實(shí)驗(yàn)均反復(fù)3次。制圖應(yīng)用Origin8.5手機(jī)軟件。