2.2 HPLC法檢驗(yàn)PQQ

本試驗(yàn)最先分析了別的離子交換柱檢驗(yàn)PQQ，結(jié)果發(fā)覺一般C18柱沒法使PQQ合理保存，拆換流動(dòng)性相工業(yè)甲醇和乙腈，或是是梯度方向過柱都不可以保存PQQ。此外發(fā)覺更改pH能夠使PQQ有一定的保存，但峰形較弱，且托尾比較嚴(yán)重，而且無法非常好分離出來試品發(fā)酵物中的PQQ。充分考慮PQQ正負(fù)極很大，因而選用耐100%水的COSMOSIL Packed Column 5C18-PAQ正相反離子交換柱來使PQQ有有效的保存。將準(zhǔn)備好的七個(gè)不一樣含量的PQQ標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（100，50，25，12.5，6.125，5，2.5 mg/L）開展HPLC檢驗(yàn)，每一個(gè)濃度值持續(xù)氣相3次，每一次氣相20 μ L。結(jié)果如圖所示1所顯示。不一樣含量的PQQ均在3.56 min上下出峰。伴隨著PQQ濃度值的提升，峰總面積也逐步提升。因而PQQ濃度值與峰總面積呈成正比的關(guān)聯(lián)。以PQQ濃度值為橫坐標(biāo)軸，色譜儀峰總面積為縱軸，制作標(biāo)曲，線性相關(guān)為y=30.27x 7.32，R2=0.9998，表明線性相關(guān)優(yōu)良。選用COSMOSIL Packed Column 5C18-PAQ正相反離子交換柱檢驗(yàn)PQQ，運(yùn)作時(shí)間較短，PQQ出峰時(shí)間早，檢驗(yàn)高效率。本研究創(chuàng)建的HPLC法檢驗(yàn)PQQ具備優(yōu)良的可行性分析，可做為菌苗產(chǎn)PQQ的復(fù)篩方式。

2.3菌種的挑選和評(píng)定

經(jīng)光譜法初篩，從100好幾個(gè)試樣中挑選到50多枝PQQ造成菌，大部分的生產(chǎn)量在2~5 mg/L，極少數(shù)能夠做到10 mg/L上下，HPLC復(fù)篩后在其中PQQ生產(chǎn)量最大的1株為20.6 mg/L，峰圖如圖2所顯示，PQQ在3.57 min出峰，這也是沒經(jīng)提升已報(bào)導(dǎo)的搖瓶較高生產(chǎn)量。

該菌種的菌體在工業(yè)甲醇培養(yǎng)液平板電腦上為奶白色，濃稠的，邊沿齊整，直徑較小，為1~2 mm。菌細(xì)胞為球形，革蘭氏陽性菌呈陰性，不產(chǎn)芽胞，有莢膜，無微絨毛。該菌種在以工業(yè)甲醇和甲胺為氮源的培養(yǎng)液中可以優(yōu)良生長(zhǎng)發(fā)育，能運(yùn)用D-葡萄糖水，綿白糖，葡萄糖和麥芽糖醇。在以氨鹽、磷酸鹽、牛肉膏、蛋白胨和酵母膏為氮源的培養(yǎng)液里能較好生長(zhǎng)發(fā)育。選用PCR技術(shù)性增加該菌種的16s rDNA 基因序列，經(jīng)上海生工轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。根據(jù)在 NCBI網(wǎng)址中開展開放閱讀框編碼序列檢索及核對(duì)，從這當(dāng)中選擇開放閱讀框較高菌種的16s rDNA基因序列，以集團(tuán)公司外菌苗作對(duì)比，根據(jù)MEGA手機(jī)軟件，用臨接法（Neighbor-Joining）搭建系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果如圖所示3所顯示，該菌種與 Methylopila henanensis strain LYBFD3-16A2的開放閱讀框最大，為99%。綜合性菌體及菌體形狀特點(diǎn)、16s rDNA序列剖析，評(píng)定該菌種為Methylopila sp.菌種，取名為Methylopila sp.Z1。

2.4 工業(yè)甲醇成分的提升

科學(xué)研究工業(yè)甲醇的差異加上濃度值（0.5%，1%，1.5%，2%，2.5%，3%，3.5%，4%）對(duì)OD600和PQQ生產(chǎn)量的危害，結(jié)果如圖4所顯示。在0.5%~2.5%的含量范疇內(nèi)，伴隨著工業(yè)甲醇容積含量的提升 ，菌體OD600和PQQ生產(chǎn)量也慢慢提升，當(dāng)工業(yè)甲醇濃度值為2.5%時(shí)，OD600和PQQ生產(chǎn)量均實(shí)現(xiàn)最大，再次提升工業(yè)甲醇濃度值，OD600和PQQ生產(chǎn)量均有顯著降低。這是由于工業(yè)甲醇做為病菌生長(zhǎng)的唯一氮源，而且或是細(xì)菌細(xì)胞工業(yè)甲醇脫氨酶的底物，在其濃度值較低時(shí)，不能給予動(dòng)能使細(xì)胞生長(zhǎng)，也不能生產(chǎn)制造過多的PQQ代謝到培養(yǎng)液中，造成PQQ生成高效率極低。當(dāng)工業(yè)甲醇濃度值慢慢增強(qiáng)時(shí)，體細(xì)胞能夠使用的氮源提升，菌體OD600和PQQ生產(chǎn)量也逐步提升；當(dāng)工業(yè)甲醇濃度值超出2.5%時(shí)，因?yàn)楣I(yè)甲醇的毒素使體細(xì)胞損害，而且底物濃度值過高抑止工業(yè)甲醇脫氫酶的活性，造成菌體OD600和PQQ生產(chǎn)量降低。因而，2.5%的工業(yè)甲醇容積濃度值針對(duì)菌體生長(zhǎng)發(fā)育和PQQ生成是最好的選擇。

3 結(jié)果

現(xiàn)階段PQQ的檢查辦法具體有資產(chǎn)重組酶法，氧化還原反應(yīng)法，光譜法和HPLC，在其中資產(chǎn)重組酶法常用到的葡萄糖水脫氨酶獲取繁雜，提純?nèi)^程繁雜，且取得的酶活不高，不能適用很多的菌苗挑選；氧化還原反應(yīng)法中使用到的鉻黑T鈦酸異丙酯氟苯四氮唑藍(lán)（NBT）易受培養(yǎng)液中別的成份的影響，導(dǎo)致呈陰性結(jié)果。光譜法實(shí)際操作簡(jiǎn)易，檢驗(yàn)迅速，但也有可能遭受培養(yǎng)液中有著類似光波長(zhǎng)OD值的危害，但本試驗(yàn)使用的是工業(yè)甲醇無機(jī)物培養(yǎng)液，并根據(jù)HPLC檢驗(yàn)試品發(fā)覺，基本上沒有影響，因而光譜法做為PQQ造成菌的初篩是高效率有效的。本試驗(yàn)還構(gòu)建了新的HPLC法檢驗(yàn)PQQ，選用親水性離子交換柱COSMOSIL Packed Column 5C18-PAQ，促使PQQ有有效的保存，而且試品運(yùn)作時(shí)間較短，PQQ在3.56 min出峰，出峰時(shí)間早，現(xiàn)場(chǎng)采樣短，峰形無托尾，為PQQ檢驗(yàn)給予一種新的改善方式。

因?yàn)镻QQ的微生物生成原理沒有取得徹底詮釋，根據(jù)基因工程技術(shù)和新陳代謝更新改造提升PQQ的生產(chǎn)量遠(yuǎn)小于野山菌的生產(chǎn)量，因而從自然環(huán)境中挑選具備增產(chǎn)PQQ工作能力的菌株是十分必要的。本試驗(yàn)從試品中挑選到一株P(guān)QQ增產(chǎn)菌，經(jīng)評(píng)定為Methylopila sp.屬，取名為Methylopila_sp. Z1，沒經(jīng)提升的搖瓶生產(chǎn)量做到20.6 mg/L，歸屬于已報(bào)導(dǎo)的較高質(zhì)量。Z1菌種承受較高工業(yè)甲醇，在培養(yǎng)液工業(yè)甲醇濃度值為2.5%時(shí)，PQQ生產(chǎn)量達(dá)26.7 mg/L，對(duì)比于原始濃度值提升了28%。Z1是一株有增產(chǎn)PQQ發(fā)展?jié)摿Φ木N，事后發(fā)酵設(shè)備塑造和提升加工工藝將進(jìn)一步提高PQQ生產(chǎn)量。