羥基甲酸乙酯（Ethylcarbamate，EC）是一種在小動(dòng)物甚至人體內(nèi)具備潛在性致癌物質(zhì)的2A類致癌物質(zhì)，存有于多種多樣發(fā)酵食品及酒精飲料中，如生抽、乳酪、紅酒、米酒等。研究表明，尿素溶液、瓜氨酸、氨甲酰硫酸銨、氰酸和焦炭酸二甲酸是EC產(chǎn)生的磷酸激酶物，在其中酵母和一部分乳酸菌飲料根據(jù)精氨酸新陳代謝路徑造成的尿素溶液和瓜氨酸是最重要的2種磷酸激酶物。

酒水的瓜氨酸關(guān)鍵自精氨酸脫亞胺酶方式新陳代謝造成，在這里一方式中包含3種重要酶，各自為精氨酸脫亞胺酶（Argininedeimidase，ADＩ，EC3.5.3.6）、鳥(niǎo)氨酸氨甲?；D(zhuǎn)移酶（Ornithinetranscarbamoylase，OTC，EC2.1.3.3）和羥基苯甲酸蛋白激酶（Carbamatekinase，CK，EC2.7.2.2）。該方式將精氨酸水解反應(yīng)，最后轉(zhuǎn)換為鳥(niǎo)氨酸、氨和二氧化碳。

現(xiàn)階段有關(guān)鳥(niǎo)氨酸氨甲酰轉(zhuǎn)移酶的分析較少，關(guān)鍵聚集在人體內(nèi)，因?yàn)槭歉尾磕蛩匮h(huán)的必不可少酶，因而OTC酶的缺少常造成總想睡覺(jué)、惡心嘔吐、精神實(shí)質(zhì)生長(zhǎng)遲緩等病癥，與此同時(shí)OTC的缺少是否也可做為肝細(xì)胞癌的初期檢測(cè)指標(biāo)值之一。依據(jù)以前的研究發(fā)現(xiàn)，OTC與羥基甲酸乙酯的產(chǎn)生呈負(fù)關(guān)聯(lián)性，即OTC的表述對(duì)EC的產(chǎn)生有抑制效果，殊不知OTC與EC的立即關(guān)聯(lián)性末見(jiàn)科學(xué)研究報(bào)導(dǎo)。

短乳酸桿菌是一類革蘭氏陽(yáng)性兼性厭氧菌，在含蛋白質(zhì)的小動(dòng)物、綠色植物發(fā)醇商品及其溫血爬行動(dòng)物的消化道中十分普遍，做為一般覺(jué)得安全性（Generallyrecognizedassafe，GRAS）的食品級(jí)不銹鋼微生物菌種，在食品類、工業(yè)生產(chǎn)、農(nóng)業(yè)及制藥等行業(yè)中亦有著關(guān)鍵的使用使用價(jià)值。發(fā)掘益天性乳酸菌飲料源的抗氧化物是現(xiàn)在我們的側(cè)重點(diǎn)之一。

本分析以短乳酸桿菌中的鳥(niǎo)氨酸氨甲酰基轉(zhuǎn)移酶為目標(biāo)，根據(jù)分子克隆表述方式和Ni-NTA提純方式，得到很多純度高的OTC酶，在米酒發(fā)醇的不一樣環(huán)節(jié)可以直接加入到酒質(zhì)中，科學(xué)研究其與EC中間的相互影響，為發(fā)掘其潛在性的工業(yè)生產(chǎn)使用使用價(jià)值打下基礎(chǔ)。

1 原材料與方式

1.1 原材料與實(shí)驗(yàn)試劑

短乳酸桿菌（Lactobacillusbrevis）和質(zhì)粒pET28a由本試驗(yàn)室儲(chǔ)存，大腸埃希菌（Escherichiacoli）BL21（DE3），全試金企業(yè)。病菌基因獲取檢測(cè)試劑盒、質(zhì)粒DNA獲取檢測(cè)試劑盒、PCR物質(zhì)回收利用檢測(cè)試劑盒、瓊脂糖電泳回收利用檢測(cè)試劑盒、Ni-NTA瓊脂糖環(huán)氧樹(shù)脂、L-精氨酸、L-瓜氨酸、DL-鳥(niǎo)氨酸、茚三酮、異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（ＩPTG）、鹽酸卡那霉素（Kan），生工生物工程項(xiàng)目（上海市）股權(quán)有限責(zé)任公司；T4DNA連接酶、約束性內(nèi)切酶BamHＩ、SalＩ，TaKaRa企業(yè)；麥曲、酒藥，浙江省塔牌黃酒企業(yè)。

1.2 方式

1.2.1 鳥(niǎo)氨酸氨甲?；D(zhuǎn)移酶的復(fù)制

短乳酸桿菌OTC酶的正方向引物設(shè)計(jì)編碼序列為：5’-cgcggatccATGACTAAGGATTTTCGGGAAAATGTA-3’（下橫線為BamHＩ鑒別編碼序列），反方向引物設(shè)計(jì)編碼序列為：5’-acgcgtcgacTTAAGCTCGTGGAATGAATAAGTTACCT-3’（下橫線為SalＩ鑒別編碼序列）。以短乳酸桿菌的基因DNA為模版開(kāi)展基因擴(kuò)增，PCR物質(zhì)經(jīng)1%瓊脂糖電泳電泳原理認(rèn)證后開(kāi)展提純。

1.2.2 資產(chǎn)重組表述質(zhì)粒的搭建

選用約束性內(nèi)切酶BamHＩ和SalＩ各自對(duì)短乳酸桿菌OTC基因片段和媒介pET-28a開(kāi)展雙酶切。酶切物質(zhì)經(jīng)檢測(cè)試劑盒回收利用后，聯(lián)接并轉(zhuǎn)換大腸埃希菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，施膠在含卡那霉素的LB平板電腦上，經(jīng)菌體PCR認(rèn)證后，挑選獲得呈陽(yáng)性復(fù)制，并轉(zhuǎn)錄組測(cè)序評(píng)定目地基因序列。

1.2.3 資產(chǎn)重組鳥(niǎo)氨酸氨甲?；D(zhuǎn)移酶的誘發(fā)表述與分離純化

挑菌呈陽(yáng)性單菌體注射于5mL含卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，于37℃，200r/min震蕩塑造留宿。按1%（摩爾分?jǐn)?shù)）接種量接轉(zhuǎn)于200mL的LB培養(yǎng)基中，再次于37℃，200r/min震蕩塑造，至OD600nm做到0.6～0.8時(shí)，添加異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（ＩPTG），于25℃，180r/min誘發(fā)塑造留宿。離心式搜集菌體后，添加30mL緩沖溶液（50mmol/LNaH2PO4，300mmol/LNaCl，20mmol/LＩmidazole，pH8.0）重懸菌體，接著冰水浴超聲波粉碎體細(xì)胞，于4℃，12000r/min離心式20min，得到上清液。參考Ni-NTA瓊脂糖環(huán)氧樹(shù)脂的應(yīng)用說(shuō)明方法，選用親和層析提純重組蛋白，接著運(yùn)用SDSPAGE檢驗(yàn)蛋白質(zhì)純凈度及分子質(zhì)量。

1.2.4 米酒釀制全過(guò)程及實(shí)驗(yàn)解決方式

以0.8kg檽米為原材料，30℃下浸米2d，高溫蒸制后制冷，添加160g麥曲和1.6g酒藥及0.96L水，攪拌均勻后于28℃發(fā)醇。以未作任意解決的當(dāng)然發(fā)醇米酒做為對(duì)照實(shí)驗(yàn)（CK），在發(fā)醇第5天添加提純后的鳥(niǎo)氨酸氨甲酰基轉(zhuǎn)移酶（5D），在發(fā)醇第12天添加同樣濃度值的鳥(niǎo)氨酸氨甲?；D(zhuǎn)移酶（12D），剖析較為發(fā)醇全過(guò)程中EC以及有關(guān)類化合物的差別。

1.2.5 羥基甲酸乙酯的HPLC-FLD測(cè)量

測(cè)定法參考Fu等[3]的報(bào)導(dǎo)，試品與0.1mL，1.5mol/L硫酸和0.2mL，0.01mol/L占噸醇正丙醇水溶液衍化后，根據(jù)高效液相色譜色譜分析檢驗(yàn)。以工業(yè)甲醇和水做為流動(dòng)性相，瑩光探測(cè)器激起光波長(zhǎng)233nm，發(fā)送光波長(zhǎng)600nm，梯度方向過(guò)柱氣相。

1.2.6 尿素溶液、瓜氨酸和鳥(niǎo)氨酸氨甲?；D(zhuǎn)移酶活的測(cè)量

尿素溶液和瓜氨酸的檢查方式各自參考陳宜宜等和Boyde等的參考文獻(xiàn)上述，根據(jù)與鉻黑T的顯色反應(yīng)來(lái)檢驗(yàn)發(fā)酵物中的成分。
取發(fā)酵物超聲波15min粉碎體細(xì)胞，于4℃，12000r/min離心式20min，取上清為原蛋白質(zhì)提取液。依據(jù)茚三酮顯色反應(yīng)來(lái)測(cè)量OTC酶活，蛋白質(zhì)成分則選用Bradford法完成測(cè)量。本實(shí)驗(yàn)中OTC酶活界定為每分水解反應(yīng)1mg蛋白造成1μmol鳥(niǎo)氨酸所須要的酶量為一個(gè)酶活企業(yè)。

1.2.7 米酒基本物理化學(xué)質(zhì)量的檢測(cè)分析

1.2.7.1 米酒中分散碳水化合物的含水量測(cè)量

選用日本日立L-8900碳水化合物檢測(cè)儀開(kāi)展測(cè)量。檢驗(yàn)基本原理為選用茚三酮做為衍化劑與碳水化合物衍化后檢測(cè)分析。前解決辦法為：取50mL米酒試品，加0.1mol/L鹽酸溶液超聲波震蕩5min，加5%磺酸水楊酸鈉除去蛋白質(zhì)，離心式后選用氮吹儀濃縮，加0.02mol/L硫酸2mL，震蕩后過(guò)膜，上機(jī)操作檢驗(yàn)。

1.2.7.2 揮發(fā)物口味成分的檢驗(yàn)

將8mL酒樣和0.2gNaCl添加頂空罐中，50℃下磁力攪拌加溫15min后，將提純頭插進(jìn)頂空罐中，再次于50℃下加溫30min后入樣。GC色譜儀標(biāo)準(zhǔn)：載氣為N2，流動(dòng)速度為1mL/min，無(wú)分離氣相；程序升溫：原始柱溫40℃，維持5min，以5℃/mL的速度加熱至230℃，維持10min。氣相口溫度250℃，GC分析時(shí)間2.5min。質(zhì)譜分析標(biāo)準(zhǔn)：電子器件負(fù)電子離子源（EＩ）電子能量為70eV，離子源溫度250℃，插口溫度250℃，檢驗(yàn)口工作電壓為350V。掃描儀方法為全掃描儀，質(zhì)量范圍為35～350。

1.2.7.3 電子器件舌味蕾剖析

相對(duì)性于感觀鑒評(píng)方式，電子器件舌完成了酸、苦、澀、咸、鮮和清甜味等基本上味及回味無(wú)窮的智能化點(diǎn)評(píng)，具備結(jié)果平穩(wěn)且受影響小的優(yōu)勢(shì)。

加入適量被測(cè)試品放置電子器件舌檢測(cè)杯里，對(duì)其酸、甜、苦、澀、咸、鮮等基本上味及回味無(wú)窮開(kāi)展測(cè)量，不一樣味蕾與感應(yīng)器一一對(duì)應(yīng)，全部感應(yīng)器各自在對(duì)照品水溶液和米酒試品中泡浸、清洗，測(cè)得電勢(shì)差值Vr和Vs，根據(jù)對(duì)Vs-Vr值的測(cè)算，就可以對(duì)米酒的酸、甜、苦、澀、咸和鮮香等基本上味和回味無(wú)窮開(kāi)展剖析。每一個(gè)試品反復(fù)測(cè)試4～5次，為降低系統(tǒng)偏差，選后3次列入數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.8 數(shù)據(jù)信息數(shù)據(jù)分析

每一個(gè)實(shí)驗(yàn)反復(fù)3次，選用SPSS手機(jī)軟件對(duì)標(biāo)值開(kāi)展差別顯著性分析。