伴隨著大家生活水平的提升和對食品類營養(yǎng)健康作用了解的提升,在我國食品油的需求量持續(xù)提升,油菜子是中國主要的燃料和農(nóng)作物之一,食用油不但含有身體所必要的碳水化合物和油酸,并且能長時間地存儲,為了更好地更好的達(dá)到眾多群眾對高品質(zhì)食品油的要求,食用油質(zhì)量改進(jìn)已成為了當(dāng)今油菜子繁育行業(yè)的網(wǎng)絡(luò)熱點。

食用油的主要成分是油酸,植物油脂的好壞由油酸決策,而植物油脂油酸的優(yōu)劣則首要在于其碳?xì)浠衔镦滐柡蜖顟B(tài)水平。油酸依據(jù)碳?xì)浠衔镦滐柡蜖顟B(tài)與不飽和脂肪分成3類:飽和脂肪(關(guān)鍵有豆蔻酸、聚醚等)、單不飽和脂肪(脂肪酸、芥酸等)和多不飽和脂肪(脂肪酸、a亞麻酸等),有研究表明,預(yù)防糖尿病的基本方針集中化在將膳食中的飽和脂肪酸和反式脂肪酸變化為不飽和脂肪酸,飽和脂肪溶點較高,易凝結(jié)在微血管內(nèi)壁,進(jìn)而造成血壓高和主動脈粥樣硬化,且飽和脂肪還造成血碳水化合物濃度值升高,不飽和脂肪溶點較低,非常容易被身體消化吸收。

本分析以湖南稻谷油菜子抗病性重點實驗室早期對高a亞麻酸甘藍(lán)型油菜子(Brassicanapus)近等遺傳基因系開展的miRNA轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果為基本,挑選到的與油酸新陳代謝有關(guān)的bna-miR396以及靶遺傳基因乙酰轉(zhuǎn)移酶遺傳基因(Acetyltransferasegene,AT)。研究表明,AT根據(jù)催化反應(yīng)酰胺基團(tuán)從乙酰輔酶A(乙酰CoA,AcetylCoA)遷移到其功效底物芳香胺及雜環(huán)化合物丙烯胺化學(xué)物質(zhì)上,參加油酸轉(zhuǎn)換與溶解,AT缺少會延遲綠色植物盛開時間并減少育性。運用同源基因復(fù)制,獲得AT遺傳基因的兩個復(fù)制,各自搭建過表達(dá)載體與影響媒介,轉(zhuǎn)換擬南芥,剖析轉(zhuǎn)基因水稻擬南芥子孫后代種籽油酸構(gòu)成,研究該遺傳基因在油酸生成流程的作用,以求推動甘藍(lán)型油菜子人體脂肪生成分子結(jié)構(gòu)原理科學(xué)研究。

1 原材料和方式

1.1 實驗原材料

高a亞麻酸甘藍(lán)型油菜子近等遺傳基因系（低a亞麻酸株系575，a亞麻酸成分為5.1%；高a亞麻酸株系574，a亞麻酸成分9.8%),野生型擬南芥(WT)由湖南省農(nóng)業(yè)大學(xué)我國燃料改進(jìn)核心給予。大腸埃希菌感受態(tài)DH5α,約束性內(nèi)切酶、dNTP、T4DNALigationKit購自北京市擎科生物高新科技有限責(zé)任公司；pMD18-T媒介由本試驗室儲存；pCambia1300-35s-N1、pCambia1300-RNAi媒介購于上海市康顏生物技術(shù)有限責(zé)任公司；本實驗中使用到的引物設(shè)計均由北京市擎科生成。

1.2 AT分子克隆

運用數(shù)據(jù)庫查詢實現(xiàn)查找,發(fā)覺AT遺傳基因有兩個復(fù)制,各自在A基因和C基因,并為此編碼序列(GSBRNA2T00114025001、GSBRNA2T00148464001)開展事后引物設(shè)計(表1),在其中5′端酶切位點前的編碼序列用以資產(chǎn)重組聯(lián)接。

選用TransZolUP綠色植物總RNA獲取檢測試劑盒(北京市全式金)獲取低a亞麻酸甘藍(lán)型油菜子株系575自交受粉后20～35d混和種籽總RNA,并且用TransScriptOne-StepgDNARemovalandcDNASynthesisSuperMix反轉(zhuǎn)錄檢測試劑盒(北京市全式金)生成cDNA第一鏈,為此為模版,開展PCR擴(kuò)增,增加管理體系包括KOD-FX聚合酶1μL,2×PCRBuffer25μL,dNTP(2.5μmol/L)10μL,正反面向引物設(shè)計各0.2μmol/L,cDNA低于500ng,用ddH2O補充至50μL。反映情況為98℃2min預(yù)轉(zhuǎn)性；98℃10s,60℃30s,68℃2min,3五個循環(huán)系統(tǒng)；68℃7min拓寬。

經(jīng)PCR提純回收利用后，與pMD18-T媒介相接，轉(zhuǎn)換到大腸埃希菌中，由北京市擎科企業(yè)開展轉(zhuǎn)錄組測序。

1.3 生物信息學(xué)剖析

用SnapGene3.2.1將復(fù)制到的靶基因序列譯成碳水化合物，經(jīng)NCBI數(shù)據(jù)庫查詢BlastP開展評定后,預(yù)測分析相匹配蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu),包含碳水化合物構(gòu)成、理化性質(zhì)等；各自登陸PredictProtein、SOPMATMHMM網(wǎng)址開展蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位預(yù)測分析、構(gòu)造預(yù)測分析、跨膜螺旋式區(qū)剖析；根據(jù)SWISS-MQPEL搭建蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)模型。

1.5 過表達(dá)載體與RNAi影響載體構(gòu)建

用BamHI和SalI雙酶切pCambia1300-35s-N1媒介,膠回收利用，物質(zhì)開展身體之外同源重組反映,得到重組質(zhì)粒。

用XbaI及BamHI雙酶切pCambial300-RNAi媒介及其每個遺傳基因的RNAi精彩片段的PCR物質(zhì),具體做法參照劉曉等,并做好改善,膠回收利用后開展聯(lián)接,得到重組質(zhì)粒。轉(zhuǎn)錄組測序檢測恰當(dāng)后,用PstI和Sal.I雙酶切重組質(zhì)粒及每個遺傳基因的RNAi精彩片段的PCR物質(zhì),再度開展聯(lián)接,轉(zhuǎn)換,得到最后的RNAi媒介。

將搭建好的過表達(dá)載體與RNAi影響媒介轉(zhuǎn)到農(nóng)桿菌中,以野生型擬南芥為蛋白激酶,開展遺傳基因轉(zhuǎn)換,得到T₀種籽；用潮霉素挑選T₀擬南芥呈陽性苗并栽種,以后，用PCR評定轉(zhuǎn)基因水稻苗,扣除獲得T₁種籽。

1.6 油酸成份測量

選用SP-6890型氣相色譜、FID探測器、N3000色譜儀工作平臺、毛細(xì)血管離子交換柱DB-23對轉(zhuǎn)基因水稻擬南芥T₁種籽開展油酸成份測量,對七個關(guān)鍵的油酸成份開展剖析,測量時取五個轉(zhuǎn)基因水稻子孫后代株系,每一個產(chǎn)品檢測約30粒種籽。

2 結(jié)果與剖析

2.1 靶遺傳基因與特異性影響精彩片段復(fù)制及檢驗結(jié)果

以低a亞麻酸甘藍(lán)型油菜子20～35d自交種cDNA為模版,高保真音響增加了乙酰轉(zhuǎn)移酶遺傳基因的兩個復(fù)制,尺寸均為1350bp。各自對兩個靶遺傳基因特異性精彩片段開展PCR高保真音響增加,獲得了目地精彩片段長短尺寸的DNA片段。

2.2 生物信息學(xué)剖析

2.2.1 蛋白一級結(jié)構(gòu)預(yù)測分析與剖析

以SnapGene3.2.一分別對AT遺傳基因漢語翻譯下來的氨基酸序列,根據(jù)ExPASy-ProtParamtool開展理化性質(zhì)分析表明(表3),AT遺傳基因的兩個復(fù)制114與148碳水化合物均為449個，相對分子質(zhì)量約50.5ku,114編號的碳水化合物偏中性化而148編號的蛋白質(zhì)偏偏堿。不穩(wěn)定指數(shù)表明114與148均為平穩(wěn)蛋白質(zhì),且吸水性較弱，歸屬于脂溶性蛋白質(zhì)。