過(guò)氧化氫酶(CAT)為鐵元素卟啉的融合酶，是一種普遍出現(xiàn)的抗氧化酶，能消除食品類、食用添加劑和調(diào)料在消毒滅菌、漂白劑、生產(chǎn)加工后造成或殘存的雙氧水，也可以消除乳制品等食物在紫外線照射時(shí)造成的雙氧水導(dǎo)致的臭味，因而測(cè)量CAT活力在食品檢測(cè)行業(yè)有著關(guān)鍵實(shí)際意義。酶的活性一般通過(guò)底物的變動(dòng)來(lái)測(cè)量，而酶促反應(yīng)具備高寬比特異性、高效率、不穩(wěn)定和可調(diào)整等特性，因而測(cè)量CAT活力的辦法各種各樣。高錳酸鉀溶液滴定法因常用機(jī)器設(shè)備簡(jiǎn)易，做為國(guó)家行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)和實(shí)驗(yàn)教學(xué)一直被應(yīng)用，但高錳酸鉀溶液不穩(wěn)定，實(shí)驗(yàn)試劑水溶液校準(zhǔn)難，儲(chǔ)存難，滴定管全過(guò)程中難以避免地存有很大的人為因素分辨偏差。當(dāng)今化學(xué)動(dòng)力學(xué)分光光度法變成一大閃光點(diǎn)，董等以二苯胺磺酸鈉為底物進(jìn)行CAT著色驅(qū)動(dòng)力分光光度法測(cè)量，但著色敏感度比較有限，H₂O₂表觀克分子吸光度指數(shù)ε＜5.0×10²L／(mol·cm)。文中以碘量法為基本，搭建碘酸鉀-木薯淀粉著色分光光度法測(cè)量CAT活力的新管理體系。在鹽酸物質(zhì)中，過(guò)氧化氫空氣氧化碘酸鉀轉(zhuǎn)化成碘，碘與木薯淀粉快速響應(yīng)展現(xiàn)深藍(lán)色，著色液在600nm光波長(zhǎng)上有較大吸取峰。CAT催化反應(yīng)H₂0₂溶解，根據(jù)CAT添加前后左右OD值轉(zhuǎn)變值完成酶促反應(yīng)測(cè)量。該辦法簡(jiǎn)易，基本原理清楚，耗品少，相對(duì)性高錳酸鉀溶液滴定法，檢出限更低，特別適合于微生物試品少量CAT活力剖析。本試驗(yàn)用μtmol／mL(U／mL)來(lái)表明酶液的酶促反應(yīng)，即lmL過(guò)氧化氫酶水溶液所耗費(fèi)雙氧水摩爾質(zhì)量(μm01)。

一、試驗(yàn)一部分

1、儀器設(shè)備與實(shí)驗(yàn)試劑

7230G型由此可見(jiàn)光度計(jì)(深圳公司)；電子分析天平(0.1mg，上海市天平儀器廠)。

CAT標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(上海市鼓臣生物科技有限責(zé)任公司)貯備液：配置濃度值lmg／mL(活力約為5000U／mL)，碘量法校準(zhǔn)；CAT切削液：0.1U／mL(應(yīng)用前由貯備液稀釋液)；H₂0₂栽培基質(zhì)液：1μmol／mL(取0.6mL，3％H202稀釋液至500mL)；0.1mol／LH₂S0₄水溶液；0.01mol／L碘化鉀溶液；5g／L木薯淀粉液；0.1mol／L聚磷酸鹽緩沖液(pH=7.0)。

2、測(cè)定法

取50ml容量瓶一只，添加CAT樣液(酶促反應(yīng)低于2U／mL)1.00mE、H₂0₂栽培基質(zhì)液2.00mL，25℃水浴反映30min后馬上添加1.5mL鹽酸停止反映，加碘酸鉀5mL，60℃水浴加熱40min，制冷，加木薯淀粉3mL，滴定劑，以純凈水作參比液，在光波長(zhǎng)600nm處測(cè)OD值A(chǔ)，與此同時(shí)進(jìn)行酶試劑空白OD值A(chǔ)₀測(cè)量，依據(jù)△A(△A=A₀一A)明確過(guò)氧化氫酶活力E。

二、結(jié)果探討

1、光譜圖與較大消化吸收光波長(zhǎng)

不一樣管理體系光譜圖見(jiàn)圖1。木薯淀粉與碘化鉀溶液在可見(jiàn)光波長(zhǎng)區(qū)無(wú)消化吸收峰(圖1曲線圖1)；木薯淀粉、碘酸鉀與雙氧水水溶液中，雙氧水空氣氧化碘酸鉀，淀粉溶液呈深藍(lán)色，600nm上有較大消化吸收(圖1曲線圖3)，峰形銳利，最高值較高，H₂O₂表觀克分子吸光度指數(shù)ε₆₀₀=2.79×10⁴L／(mol·cm)；添加CAT后，著色受抑止(圖1曲線圖2)，但峰位未發(fā)生改變，這表明反映僅出現(xiàn)于雙氧水與碘酸鉀中間，著色水平與雙氧水成分相關(guān)。試驗(yàn)選擇600nm作測(cè)量光波長(zhǎng)。

2、碘酸鉀使用量危害

僅對(duì)于非酶管理體系(E=0U／mL)，單純性調(diào)查了碘酸鉀使用量危害。結(jié)果顯示，A隨碘酸鉀容積擴(kuò)大，在0～3mL中間，增長(zhǎng)幅度較快，很多的碘酸鉀被氧化；在3～5mL中間，增長(zhǎng)幅度變緩，這時(shí)候的碘酸鉀關(guān)鍵做為助有機(jī)溶劑，I₂是非極性分子，水溶差，過(guò)多碘酸鉀促進(jìn)碘合正離子產(chǎn)生(I₂ I^–=I^–₃)，溶解性提高。顯而易見(jiàn)，過(guò)多碘酸鉀合理緩解了著色自然環(huán)境，5mL時(shí)A穩(wěn)定不會(huì)改變。試驗(yàn)挑選5mL碘酸鉀。

3、木薯淀粉使用量

用該方式取50ml容量瓶一只，添加CAT樣液(酶促反應(yīng)低于2U／mL)1.00mE、H₂0₂栽培基質(zhì)液2.00mL，25℃水浴反映30min后馬上添加1.5mL鹽酸停止反映，加碘酸鉀5mL，60℃水浴加熱40min，制冷，加木薯淀粉3mL，滴定劑，以純凈水作參比液，在光波長(zhǎng)600nm處測(cè)OD值A(chǔ)，與此同時(shí)進(jìn)行酶試劑空白OD值A(chǔ)₀測(cè)量，依據(jù)△A(△A=A₀一A)明確過(guò)氧化氫酶活力E。別的標(biāo)準(zhǔn)不會(huì)改變，調(diào)查了木薯淀粉使用量危害。結(jié)果顯示，在0～2.75mL中間，A隨木薯淀粉容積擴(kuò)大，2.75mL后，A趨向穩(wěn)定。試驗(yàn)挑選3mL木薯淀粉作鉻黑T。

4、鹽酸使用量

取50ml容量瓶一只，添加CAT樣液(酶促反應(yīng)低于2U／mL)1.00mE、H202栽培基質(zhì)液2.00mL，25℃水浴反映30min后馬上添加1.5mL鹽酸停止反映，加碘酸鉀5mL，60℃水浴加熱40min，制冷，加木薯淀粉3mL，滴定劑，以純凈水作參比液，在光波長(zhǎng)600nm處測(cè)OD值A(chǔ)，與此同時(shí)進(jìn)行酶試劑空白OD值A(chǔ)₀測(cè)量，依據(jù)△A(△A=A₀一A)明確過(guò)氧化氫酶活力E。別的標(biāo)準(zhǔn)不會(huì)改變，調(diào)查鹽酸容積對(duì)顯色反應(yīng)危害，并同歩進(jìn)行pH測(cè)量(圖2)。結(jié)果顯示，當(dāng)V(H₂SO₄)=1.5mL時(shí)，pH=1.80，著色最徹底，A值超過(guò)較大。0.1mol／LH₂SO₄水溶液最好使用量為1.5mL。