酶魅力對AFs溶解率的危害:將酶魅力各自為1、2、3、4U和5U的漆酶各自與10μL0.1mg/mL的AFB1標液渦流震蕩攪拌，30℃、200r/min孵育12h。對照實驗為添加同樣大小的pH5.7的0.1mol/L的PBS₁別的情況同樣。全部試驗反復3次，溶解率按式（1）測算:

（8）AFs的獲取

將孵育時間對AFs溶解率的危害:將酶魅力為3U的漆酶與10μL0.1mg/mL的AFB₁標液渦流震蕩攪拌，放置30℃、200r/min各自孵育12、24、36、48h和60h。對照實驗為添加同樣大小的pH5.7的0.1mol/L的硫酸銨緩存溶液（phosphatebuffersaline，PBS），別的情況同樣。孵育溫度對AFs溶解率的危害:將酶魅力為3U的漆酶與10μL0.1mg/mL的AFB₁標液渦流震蕩攪拌，各自放置25、30、35、40℃和45℃氣溫下，200r/min孵育12h。對照實驗為添加同樣大小的pH5.7的0.1mol/L的PBS，別的情況同樣。酶魅力對AFs溶解率的危害:將酶魅力各自為1、2、3、4U和5U的漆酶各自與10μL0.1mg/mL的AFB₁標液渦流震蕩攪拌，30℃、200r/min孵育12h。對照實驗為添加同樣大小的pH5.7的0.1mol/L的PBS₁別的情況同樣。解決的試品12000r/min離心式30s，使壁厚上的發(fā)酵物離心式至管底端，并轉換至10mL的具塞玻璃試管中，向玻璃試管中添加等大小的三氯甲烷（在陰涼處開展），渦流震蕩10min使其完全攪拌，隨后倒進離心管架中，靜放30min分層次，取頂層液態(tài)于玻璃試管中，添加等容積三氯甲烷，汲取下一層有機相發(fā)酵液于離心管架中，同樣實際操作反復3次。合拼3次有機相于氮鍋爐吹管中，于45℃N2烘干。再用甲醇溶液融解出AFs，并且用0.22μm濾紙過慮。

（9）HPLC-MS/MS檢驗AFs及標曲的制作

配置的內毒素標液和提煉的內毒素水溶液均用0.22μm濾紙過慮至高效液相瓶子中。

HPLC標準:高效液相控制模塊為安捷倫1260Infinity:Inertsil0DS-3C18色譜柱（150mmX4.6mm，3μm）；流動速度0.2mL/min；進樣量5μL；流動性相A為0.1%苯甲酸水溶液，流動性相B為工業(yè)甲醇-水（3:7，V/V）；剖析時間30min；檢驗溫度30℃。

MS/MS標準:電噴霧器離子源:檢測方式:多反映檢測；離子源溫度300℃:錐孔工作電壓15psi；撞擊工作電壓135V；撞擊動能30eV:毛細血管工作電壓4kV；品質掃描儀范疇m/z313.0～285.0。

（10）響應面試驗設計

在單要素實驗基本上，以孵育時間、孵育溫度和酶魅力做為調查要素，以AFB₁溶解率是響應值，響應面試驗設計要素與水準如表1所顯示。

（11）AFB₁溶解物質的測量及構造分析

HPLC標準:ZORBAX-SBC18色譜柱（100mmX2.1mm，3.5μm）。流動性相A為0.1%苯甲酸水溶液，流動性相B為0.1%苯甲酸–工業(yè)甲醇水溶液。梯度方向過柱程序流程:40%B，6min；60%B，保持16min；100%B，8min；一共運作30min。進樣量5μL，流動速度0.4mL/min，柱溫箱30℃。

MS標準:做霧化氣GS1工作壓力50psi；做霧化氣GS2工作壓力50psi；氣簾氣工作壓力35psi；離子源溫度550℃:離子源，工作電壓5500V；一級掃描儀去簇工作電壓100V；對焦工作電壓10V；品質掃描儀范疇m/z100～1500；二級掃描儀選用TOFMS-Productlon-IDA方式收集質譜分析數(shù)據(jù)信息，誘發(fā)撞擊解離能量分別為20、40V和60V，氣相前，用隔膜泵做品質軸校準，使品質軸偏差低于0.002%。

二、結果與剖析

1、漆酶的同宗模建結果

在本試驗常用漆酶分子結構未被分析的情形下，運用一些已經(jīng)知道漆酶分子結構的根基上同宗模建能夠，較大的程度上獲得理想的目地蛋白質三維構造。運用ChemBioDraw2014手機軟件及其MOEv2014.0901手機軟件制作并轉化成三維構造，如圖所示1所顯示?？茖W研究AFs與該酶的融合方式第一步必須搭建同宗實體模型，結果如表2和圖2所顯示。圖3剖析表明，99%的漆酶殘基坐落于蛋白質構像的有效地區(qū)，這說明本試驗搭建的漆酶同宗實體模型合乎立體化學標準，具備合理化。

2、漆酶與AFB₁的相互影響剖析

選用分子對接方式科學研究AFB₁與栓菌漆酶表層的相互影響，致力于剖析AFB₁與漆酶相互影響方式。為確立漆酶和內毒素的融合方式，選用誘發(fā)切合的對策，依據(jù)配位的構像主鏈蛋白激酶袋子容許挪動融入，將內毒素各自對收到漆酶的活性位置，獲得漆酶魅力結構域與配位的融合方式，如圖所示4所顯示，連接打分成-6.4532kca/mol。
 

依據(jù)所建立的連接實體模型，如圖所示4所顯示，AFB₁上叔丁基的氧分子可做為共價鍵的蛋白激酶，與漆酶上一個高寬比傳統(tǒng)與此同時也挨近碘離子（T1CuI）部位的His481上碳水化合物主鏈產(chǎn)生共價鍵，此外，AFB₁咪唑環(huán)上的氧分子還可以做為共價鍵的蛋白激酶，與漆酶Asn288的主鏈產(chǎn)生共價鍵，因而，His481和Asn288是漆酶和AFB₁融合時的重要碳水化合物結構域，根據(jù)共價鍵相互影響。

酶-配位的融合感染力與其說相互影響的速率相關，遭受配位的結構類型和歪曲水平及其配位和酶表層中間樣子相輔相成的危害。有研究表明共價鍵是酶與配位相互影響的重要相互作用力，參加共價鍵產(chǎn)生的氨基酸殘基被覺得是漆酶與小分子水配位相互影響的重要殘基。在其中氧分子與氨基酸殘基產(chǎn)生的氫鍵作用強過氧原子與氨基酸殘基產(chǎn)生的共價鍵，且共價鍵鍵長越少，功效越強。連接仿真模擬研究表明，存有于T1銅孤電子對層中的單純的殘基His481最很有可能與AFs產(chǎn)生相互影響，產(chǎn)生共價鍵，推斷其能夠受體空氣氧化全過程中的電子轉移，提升電子傳遞高效率，進而提升漆酶催化反應工作能力。綜合性各個方面因素導致酶對內毒素的功能工作能力存有差別，主要表現(xiàn)為連接成績不一樣。