曲霉型水豆豉的制造能夠溯源至戰(zhàn)國(guó)時(shí)期，在我國(guó)具有悠久的歷史。傳統(tǒng)式曲霉型水豆豉選用當(dāng)然注射酒曲制作，曲醅加上輔材后熟而成，具備營(yíng)養(yǎng)豐富、口味與眾不同的特征及養(yǎng)生作用。米曲霉做為曲霉型水豆豉發(fā)醇的優(yōu)越性微生物菌種，其酶系豐富多彩，可在水豆豉酒曲制作環(huán)節(jié)累積多種多樣抗氧化物，在其中的胰蛋白酶系（酸堿性、中性化、偏堿）至關(guān)重要，對(duì)水豆豉的質(zhì)量具有關(guān)鍵性功效。而在水豆豉酒曲制作全過程中，米曲霉關(guān)鍵產(chǎn)中性蛋白酶，其活力的多少影響了水豆豉發(fā)醇完善的期限和品質(zhì)，此酶可將大豆蛋白粉溶解為活性多肽、分散碳水化合物等，對(duì)水豆豉的營(yíng)養(yǎng)成分及口味產(chǎn)生具有很大功效。

在工業(yè)生產(chǎn)的情況下，選用非純種發(fā)醇對(duì)在我國(guó)水豆豉企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)制造具備關(guān)鍵實(shí)際意義。而良好的菌苗除開產(chǎn)胰蛋白酶等酶系工作能力強(qiáng)，還應(yīng)當(dāng)具有生長(zhǎng)發(fā)育速度快、產(chǎn)胞子工作能力強(qiáng)等特性，產(chǎn)胞子工作能力強(qiáng)的菌苗更易于變成發(fā)醇全過程中的優(yōu)點(diǎn)菌苗，抑止其他菌苗的成長(zhǎng)和繁育，降低霉菌環(huán)境污染，減少發(fā)醇周期時(shí)間，提升生產(chǎn)率。但純天然菌種產(chǎn)酶工作能力較弱，無法融入工業(yè)生產(chǎn)，因而科研工作者實(shí)現(xiàn)了大批量的菌苗改進(jìn)工作中。夏楊復(fù)興根據(jù)對(duì)米曲霉中性蛋白酶I遺傳基因開展定點(diǎn)突變，對(duì)搭建好的畢赤酵母Gs115基因工程技術(shù)菌開展工業(yè)甲醇誘發(fā)，發(fā)覺提升糖基化結(jié)構(gòu)域后的基因突變酶魅力較野生型提升了11.5％。殊不知基因工程技術(shù)菌種在具體的制造運(yùn)用遭受較大的限定，現(xiàn)階段在米曲霉的繁育層面依舊選用的是傳統(tǒng)的物理學(xué)化學(xué)誘變，而清華產(chǎn)品研發(fā)的自然壓室內(nèi)溫度等離子技術(shù)誘變技術(shù)性做為一種新式的誘變技術(shù)性，對(duì)比于傳統(tǒng)式的誘變方式，其具備遺傳基因損害抗壓強(qiáng)度高、基因突變覆蓋面廣、安全性方便的優(yōu)點(diǎn)，明顯提高了菌種的突變率，近些年廣泛運(yùn)用于微生物菌種繁育行業(yè)。該工藝的誘變基本原理根據(jù)大氣壓力頻射電弧放電形成的等離子技術(shù)（ARTP），等離子技術(shù)形成的很多活力顆粒與微生物菌種體細(xì)胞及周邊栽培基質(zhì)功效，造成很多的臭氧、活力氮氧自由基，并更改細(xì)胞質(zhì)的滲透性，這種活力顆粒和空氣氧化氧自由基進(jìn)到體細(xì)胞，與DNA、蛋白等分子伴侶功效導(dǎo)致DNA的同時(shí)和間接性損害，造成人體細(xì)胞的SOS等多種多樣傳統(tǒng)和非傳統(tǒng)的修補(bǔ)體制，進(jìn)而造成高效率基因突變。

曲霉型水豆豉對(duì)感觀質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)嚴(yán)苛，對(duì)其機(jī)構(gòu)形狀規(guī)定顆粒物詳細(xì)、疏松成形，因此其生產(chǎn)制造務(wù)必由整顆黃豆經(jīng)蒸制，以后發(fā)醇做成。因?yàn)椴牧系男螤钊秉c(diǎn)造成固態(tài)發(fā)酵全過程中與微生物菌種觸碰室內(nèi)空間比較有限及對(duì)流傳熱不勻稱，從而致使了曲霉型水豆豉了曲醅胰蛋白酶魅力較低。因而本論文運(yùn)用ARTP誘變技術(shù)性培育增產(chǎn)中性蛋白酶魅力米曲霉菌種，并且用整顆黃豆制做復(fù)篩培養(yǎng)液開展酶活認(rèn)證，以求提高曲醅的中性蛋白酶魅力，為曲霉型水豆豉非純種發(fā)醇確立一定的理論基礎(chǔ)。

一、原材料和方式

1、菌種

米曲霉NCU一110：從日本生抽釀制用菌粉中剝離而成，經(jīng)擎科生物轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果在NCBI網(wǎng)址開展BLAST核對(duì)后，其開放閱讀框與AspergillusoryzaeisolateF8160（Accessionnumber：MN429212.1）達(dá)到99.64％，評(píng)定為米曲霉，該菌種具備胰蛋白酶系詳細(xì)，以產(chǎn)中性蛋白酶為主導(dǎo)的特性。現(xiàn)階段由江西南昌大學(xué)中法食品工程核心儲(chǔ)藏。

2、實(shí)驗(yàn)試劑與儀器設(shè)備

磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、碳酸鉀、opo結(jié)構(gòu)脂、三氯乙酸、福林酚試劑、色氨酸、稀鹽酸（均為分析純）：天津大茂化學(xué)藥品廠；TGL一16B型離心機(jī)：英國(guó)賽默飛世爾科技有限公司；SP一756P紫外線由此可見光度計(jì)：上海市光譜儀器有限責(zé)任公司；HWS一250恒溫恒濕設(shè)備恒溫箱：上海市幼芽實(shí)驗(yàn)室儀器有限責(zé)任公司。

3、培養(yǎng)液

（1）菌種活化及儲(chǔ)藏培養(yǎng)液：土豆葡萄糖水瓊脂粉培養(yǎng)液（PDA）；

（2）初篩培養(yǎng)液：干酪素4.00g，磷酸二氫鉀0.36g，磷酸氫二鈉1.07g，氯化鎂0.04g，氯化鈣0.002g，甘露醇0.5g，氧化鈉0.16g，硫酸鋁0.002g，胰蛋白胨0.03～0.05g，瓊脂粉15g，純凈水滴定劑為1L，12l℃殺菌30min；

（3）復(fù)篩、酒曲制作培養(yǎng)液：選擇150g高品質(zhì)東北地區(qū)大豆，清理后用三倍容積的飲用水于35℃泡浸3h，控干后，121℃殺菌30min；

（4）種曲培養(yǎng)液：麥麩、豆柏、水品質(zhì)占比為：80∶20∶80，500mL三角瓶裝量料50g，水40mL，當(dāng)然pH，121℃殺菌30min；

（5）察氏培養(yǎng)液：硝酸鈉3.0g，磷酸氫二鉀1.0g，氯化鉀0.5g，甘露醇0.5g，硫酸鋁0.01g，綿白糖20g，純凈水1L，將以上藥物按序融解后，添加20g瓊脂粉加溫融化，散裝后121℃殺菌30min。

4、ARTP誘變

（1）米曲霉胞子混液制取
取活性好的米曲霉NCU一110試管嬰兒斜坡，用無菌檢測(cè)鹽水清洗即得胞子懸浮液，抽樣開展血球計(jì)數(shù)板記數(shù)，將胞子懸浮液稀釋液至10⁶CFU／mL預(yù)留。

（2）ARTP誘變標(biāo)準(zhǔn)的明確

選用氮?dú)鉃楣ぷ髦衅w，使載片與等離子技術(shù)產(chǎn)生器水射流出入口間隔約2mm，輸出功率為120W，氣總流量10L／min，對(duì)10此胞子懸浮液開展誘變解決，設(shè)定誘變時(shí)間為0、1、2、3、4、5、6、7、8、9min。梯度方向稀釋液誘變后胞子懸浮液各自為4.0×10⁴CFU／mL、4.0×10³CFU／mL和4.0×10²CFU／mL，各取100μL施膠于初篩細(xì)胞培養(yǎng)皿，30℃遮光控溫塑造3d，測(cè)算死亡率，制作至死趨勢(shì)圖。

死亡率=（對(duì)比菌體數(shù)一誘變平板電腦菌體數(shù)）／對(duì)比菌體數(shù)×100％

5、增產(chǎn)中性蛋白酶魅力菌種挑選

（1）初篩方式

挑選最好誘變時(shí)間下的胞子混液，適度稀釋液（4.0×10²CFU／mL）后施膠于初篩培養(yǎng)液，30℃塑造72h，觀查每個(gè)培養(yǎng)皿中初篩菌種的全透明圈和菌體尺寸，挑菌菌體比較大而且全透明圈顯著的60株米曲霉（序號(hào)NCU—A1-A60）單菌體注射于PDA試管嬰兒斜坡，于30℃塑造3～5d，試管嬰兒中基因突變米曲霉真菌鋪滿淺綠色胞子，將60株米曲霉與初始菌種在初篩培養(yǎng)液上開展點(diǎn)種試驗(yàn)，測(cè)算K值并取K值比較大的18株基因突變菌種開展下一步復(fù)篩試驗(yàn)。

K=全透明圈直徑／菌體直徑，K值意味著了菌種產(chǎn)胰蛋白酶的工作能力，能夠用于分辨基因突變株造成胰蛋白酶魅力的尺寸。

（2）淺盤酒曲制作復(fù)篩增產(chǎn)中性蛋白酶魅力基因突變株

將K值比較大的18株初篩菌種活性，制取胞子懸浮液并稀釋液至10⁷CFU／mL。依據(jù)曲霉型水豆豉淺盤酒曲制作加工工藝，依照1.0％的接種量，早期發(fā)酵溫度操縱在30～34℃，酒曲制作至第一8～24h，黃豆粒表層滿布乳白色真菌，開展第一次翻曲；當(dāng)曲醅發(fā)生品綠胞子時(shí)，開展第二次翻曲，溫控在28～32℃。塑造至72h抽樣，選用SB/T10317—1999中的福林酚測(cè)定方法各菌種曲醅中性蛋白酶魅力。

6、基因突變株基因遺傳可靠性認(rèn)證試驗(yàn)

將復(fù)篩獲得的數(shù)株中性蛋白酶魅力明顯提升的基因突變株和初始菌種在PDA試管嬰兒斜坡上30℃連續(xù)傳代9次，對(duì)以上菌種第一～9代水豆豉曲醅的中性蛋白酶魅力開展測(cè)量，檢驗(yàn)復(fù)篩菌種的基因遺傳可靠性。