微生物菌種的發(fā)育繁育和排泄是造成食品類(lèi)腐壞變味的主要要素。病菌人群磁感應(yīng)（QuorumSenSIng，QS）是一種取決于體細(xì)胞相對(duì)密度的數(shù)據(jù)溝通方法，以自誘發(fā)物（AuToInducerS，AIS）為人群磁感應(yīng)信號(hào)分子，它根據(jù)管控食品類(lèi)中優(yōu)點(diǎn)腐壞菌的成長(zhǎng)新陳代謝來(lái)管控食品類(lèi)腐壞過(guò)程。研究表明，人群磁感應(yīng)緩聚劑可根據(jù)與AIS受體蛋白融合，溶解AIS分子結(jié)構(gòu)和阻隔人群磁感應(yīng)通道等方式合理影響病菌人群磁感應(yīng)的表述，減少食源性病菌的高致病或致腐性。運(yùn)用人群磁感應(yīng)緩聚劑靶向治療管控病菌的人群磁感應(yīng)系統(tǒng)軟件來(lái)抑止食品類(lèi)腐壞，已變成食品保鮮行業(yè)的科研熱門(mén)之一。

近些年，科學(xué)研究專(zhuān)家在新鮮水果、蔬菜水果和中藥材等植物提取的提取液中挑選到許多 安全性、合理的活力成份，這種化學(xué)物質(zhì)做為人群磁感應(yīng)緩聚劑可合理減少微生物菌種的毒副作用。大蒜提取物是具備人群磁感應(yīng)抑止活力的化學(xué)物質(zhì)，能在亞抗菌濃度值下阻隔N-酰基高絲氨酸內(nèi)酯（AHLS）信號(hào)分子受體的人群磁感應(yīng)系統(tǒng)軟件，抑止其感病因素造成，殊不知，現(xiàn)階段有關(guān)大蒜提取物對(duì)腐壞菌腐壞工作能力的影響功效仍難得少有報(bào)導(dǎo)。

本實(shí)驗(yàn)以在發(fā)醇魚(yú)漿中挑選到的腐壞菌維氏氣單胞菌為目標(biāo)，剖析其AHLS受體的人群磁感應(yīng)狀況，研究大蒜提取物對(duì)該病菌產(chǎn)AHLS活力、生物膜系統(tǒng)產(chǎn)生工作能力、感病基因的表達(dá)和致腐工作能力的影響功效，以求運(yùn)用大蒜提取物等人群磁感應(yīng)緩聚劑做為食品保鮮劑，提升食物的安全系數(shù)和貨架期。

1 原材料與方式

1.1 原材料與實(shí)驗(yàn)試劑

原材料：新鮮蒜頭，購(gòu)于杭州潮王路農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)；魚(yú)漿，A級(jí)海產(chǎn)品銅盆魚(yú)糜，由上虞市傣之味食品類(lèi)有限責(zé)任公司給予，儲(chǔ)藏于-18℃冰柜中，預(yù)留。菌苗：維氏氣單胞菌，分離出來(lái)于發(fā)醇魚(yú)漿，加上20%凡士林，儲(chǔ)存于本試驗(yàn)室-80℃冰柜中。根癌農(nóng)桿菌[AgrobActeriumtumefAeiensA136（PcF218/PcF372）]，壯觀霉素抵抗性，使用量為50μg/mL。

實(shí)驗(yàn)試劑：苯甲酸、乙酸丁酯、二甲基亞砜（DmSO）、二甲苯為分析純級(jí)，國(guó)藥控股化學(xué)藥品有限責(zé)任公司；5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷（X-gal）、結(jié)晶紫、吖啶橙、壯觀霉素、病菌基因DnA迅速抽提檢測(cè)試劑盒、病菌總RnA迅速抽提檢測(cè)試劑盒，生工生物工程項(xiàng)目（上海市）股權(quán)有限責(zé)任公司；RP-c18F254S正相反薄層層析板，法國(guó)merck企業(yè)；AHLS標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，英國(guó)SIgma企業(yè)。
1.2儀器設(shè)備與機(jī)器設(shè)備

SPecTramaxm5酶標(biāo)儀，英國(guó)molecularDevIceS企業(yè)；LIFeEcoPcR儀，杭州市博日高新科技有限責(zé)任公司；FV300激光共聚焦光學(xué)顯微鏡，日本OLYmPUS企業(yè)；STePOne型熒光定量PcR儀，英國(guó)ABI企業(yè)；PHS-3c型數(shù)顯式酸度計(jì)，上海精科儀器設(shè)備有限責(zé)任公司；K9840全自動(dòng)凱氏定氮儀，濟(jì)南市海能儀器設(shè)備股權(quán)有限責(zé)任公司；e2695型高效率液相色譜，英國(guó)WaTerS企業(yè)；YXQ-LS-SⅡ立柱式工作壓力蒸汽滅菌鍋，上海博迅實(shí)業(yè)公司有限責(zé)任公司診療機(jī)械廠。

1.3 實(shí)驗(yàn)方式

1.3.1 病菌產(chǎn)AHLS分子結(jié)構(gòu)檢驗(yàn)

參考Ravn等的方式 ，選用微生物匯報(bào)菌分析法病菌產(chǎn)AHLS分子結(jié)構(gòu)的活力和類(lèi)型。

選用平行面劃線法剖析AHLS的發(fā)生狀況，在含1%瓊脂粉的LB平板電腦上施膠40μLX-gal（20mg/mL），將活性12h的根癌農(nóng)桿菌與待測(cè)菌平行面畫(huà)線，于30℃中塑造24h，觀查根癌農(nóng)桿菌的色澤轉(zhuǎn)變。

將待測(cè)菌細(xì)胞培養(yǎng)液離心式（8000×g，5mIn，4℃），上清液用相等堿化乙酸丁酯（0.5%苯甲酸）獲取2～3次，合拼有機(jī)相，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器蒸干有機(jī)溶劑，用DmSO再次融解，于-20℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

選用平板電腦蔓延分析法AHLS活力轉(zhuǎn)變，100mL含1%瓊脂粉的LB培養(yǎng)基中添加4～10mL活性的根癌農(nóng)桿菌和500μLX-gal（20mg/mL），混和勻稱(chēng)后竭盡平板電腦，待制冷凝結(jié)后開(kāi)洞，添加40μL待測(cè)菌AHLS萃取液，于30℃中塑造36～48h，觀查平板電腦的色澤轉(zhuǎn)變。

選用薄層色譜法（TLc）剖析病菌造成AHLS類(lèi)型，取1～10μLAHLS標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)與病菌AHLS提取液試品，點(diǎn)樣于c18反相薄層層析板。用層析液工業(yè)甲醇-水（容積比60/40）充足進(jìn)行，取下后在常溫狀態(tài)揮干有機(jī)溶劑。制取含根癌農(nóng)桿菌的固體培養(yǎng)基，傾于板上，凝結(jié)后在30℃無(wú)菌檢測(cè)密閉式玻璃容器中塑造36～48h，觀查顏色轉(zhuǎn)變。AHLS標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的濃度值分別為：0.1mmol/LN-丁?；?高絲氨酸內(nèi)酯（c4-HSL）、10μmol/LN-己?；?高絲氨酸內(nèi)酯（c6-HSL）、0.04μmol/LN-庚酰基-高絲氨酸內(nèi)酯（c7-HSL）、0.06μmol/LN-辛?；?高絲氨酸內(nèi)酯（c8-HSL）、0.8nmol/L3-氧代-己酰基-高絲氨酸內(nèi)酯（oxo-c6-HSL）和1.6nmol/L3-氧代-辛?；?高絲氨酸內(nèi)酯（oxo-c8-HSL）。

1.3.2 病菌的生長(zhǎng)曲線及細(xì)胞培養(yǎng)液PH值的測(cè)量

將活性12h的待測(cè)菌注射到100mLLB液體培養(yǎng)基中，在30℃下?lián)u床塑造24h，間距一定時(shí)間抽樣，參考GB/T4789.2-2008《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測(cè)定》記數(shù)，與此同時(shí)運(yùn)用酸度計(jì)測(cè)量細(xì)胞培養(yǎng)液PH值的轉(zhuǎn)變。

1.3.3 遺傳基因剖析

選用PcR技術(shù)指標(biāo)分析病菌的luxRI同源基因、鳥(niǎo)氨酸脫羧酶遺傳基因（ODC）、磷酸氫鈣脫羧酶遺傳基因（LDC）、微絨毛遺傳基因（flA）、延展性胰蛋白酶（AhyB）、絲氨酸胰蛋白酶遺傳基因（ser）、淀粉酶遺傳基因（liP）。將病菌留宿活性，運(yùn)用病菌DnA獲取檢測(cè)試劑盒獲取病菌DnA模版，應(yīng)用的引物設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。50μL反映管理體系，PcR增加程序流程為：預(yù)轉(zhuǎn)性95℃3mIn，轉(zhuǎn)性95℃30S，淬火55℃1mIn，拓寬72℃1mIn（3五個(gè)循環(huán)系統(tǒng)），終拓寬72℃10mIn。在其中，增加AhyB和flA遺傳基因時(shí)退火工藝為59℃。將擴(kuò)增到的基因片段開(kāi)展1%瓊脂糖電泳電泳原理，在紫外線下顯像，與此同時(shí)送到生工生物工程項(xiàng)目有限責(zé)任公司轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。將獲得的隊(duì)列開(kāi)展BLAST檢索和開(kāi)放閱讀框剖析。

1.3.4 大蒜提取物的制取

參考RaSmuSSen等的辦法制取大蒜提取物。將市面上蒜頭削皮，稱(chēng)量150g于300mL二甲苯中勻漿，提純12h完用WhaTman2號(hào)過(guò)濾紙過(guò)慮。向滲瀝液中添加150mL無(wú)菌水，在常溫情況下拌和24h，兩相分離得水相，經(jīng)0.22μm濾紙過(guò)慮后得1g/mL大蒜提取物。根據(jù)二倍稀釋液法明確大蒜提取物看待測(cè)菌的最少抗菌濃度值。

1.3.5 β-半乳糖酶促反應(yīng)的測(cè)量

將待測(cè)菌留宿活性12h，取500μL病菌細(xì)胞培養(yǎng)液注射至100mLLB液體培養(yǎng)基中，各自添加1mL不一樣濃度值的大蒜提取物（終濃度值為0.15～1.20mg/mL），以無(wú)菌檢測(cè)鹽水為對(duì)比，于30℃搖床中震蕩塑造12h，將細(xì)胞培養(yǎng)液離心式（8000×g，10mIn）得上清液。參考mIller的辦法測(cè)量微生物匯報(bào)菌的β-半乳糖酶促反應(yīng)。