沙門菌(Salmonella)病又被稱為副傷寒，是一種在皮毛小動物飼養(yǎng)全過程常用的急性傳染病，常發(fā)于6—8月，呈地區(qū)性時興，關(guān)鍵表現(xiàn)癥狀為發(fā)燙，下痢拉肚子，體重下降，發(fā)生腦出血癥狀，小產(chǎn)等。美國、荷蘭、澳大利亞等國均有北美水貂(Mustelavison)感柒沙門菌生病的報導(dǎo)，中國，在中國河北省、東北三省、山東省等地域也是有有關(guān)病例報道?，F(xiàn)階段，沙門菌的防止與醫(yī)治以抗生素藥物為主導(dǎo)。近些年對沙門菌的抗藥性科學(xué)研究數(shù)據(jù)顯示，人源、小動物源沙門菌的多重耐藥狀況和耐藥性水平日益增長，并根據(jù)飲用水和食品等方法在動物和人中間持續(xù)傳送?？咕仡愃幬餅E用，給病菌導(dǎo)致挑選工作壓力是導(dǎo)致多重耐藥狀況日益比較嚴重的首要緣由之一，因而，在養(yǎng)殖業(yè)中有效運用醫(yī)治動物疾病至關(guān)重要。

為調(diào)研秦皇島市地域北美水貂沙門菌的診斷率及耐藥性狀況，對65份水貂試品中的病菌開展分離純化，選用病菌的評定塑造、革蘭氏染色、生物化學(xué)評定和16SrDNA評定分離出來菌，選用小白鼠高致病實驗科學(xué)研究分離出來菌種的高致病，選用KB紙條法檢驗分離出來菌的抗藥性。數(shù)據(jù)顯示，經(jīng)評定總共分離出來出9株沙門菌，分離出來率13.85%(9/65)；9株沙門菌均可致小白鼠病發(fā)身亡，致死率20%—100%；9株沙門菌各自對5—11種抗生素藥物耐藥性，氟苯尼考、替米考星、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺二甲氧嘧啶和復(fù)方新諾明的耐藥性率達到100%，土霉素比較敏感率最大，為88.89%(8/9)。以上科學(xué)研究結(jié)果顯示，秦皇島市地域從水貂分離出來到的沙門菌均具備一定的發(fā)病力和多重耐藥性，為該地域水貂沙門氏菌病的預(yù)防給予參照。

文中對2019年秦皇島市地域復(fù)檢北美水貂的沙門菌帶上狀況開展調(diào)研，并對分離出來菌種的致病和抗藥性開展科學(xué)研究，致力于為該地域北美水貂沙門氏菌病的預(yù)防給出的數(shù)據(jù)適用。

1原材料與方式

1.1試品

2019年3—9月搜集秦皇島市地域病亡北美水貂病料65份，30—180日齡不一。

1.2關(guān)鍵實驗試劑

H.E.瓊脂粉培養(yǎng)液購自青島海博生物公司；革蘭氏染色液購自京博創(chuàng)脈達高新科技有限責任公司；ID32E腸桿菌科和其它非苛養(yǎng)革蘭氏陽性菌呈陰性鏈球菌評定實驗試劑條購自法國的貝克曼庫爾特企業(yè)；D2000plusDNAladder，購自中科瑞泰科技有限責任公司；2×TaqMasterMix，病菌DNA基因獲取檢測試劑盒，膠回收利用檢測試劑盒購自康為世紀生物技術(shù)有限責任公司；pMD19-T媒介，購自寶日醫(yī)(TaKaRa)生物科技有限責任公司；藥敏試驗紙條購自杭州市天宇微生物菌種科技發(fā)展有限責任公司；編碼序列測量服務(wù)項目由上海生工生物技術(shù)企業(yè)給予。昆明市小白鼠(休重20±5g)購自北京市維通利華實驗小動物有限責任公司。

1.3引物設(shè)計

病菌16SrDNA評定通用引物由上海生工生物技術(shù)企業(yè)生成。引物設(shè)計編碼序列為27F:AGAGTTTGATCCTGGCTCAG，1492R:TACGGYTACCTTGTTACGACTT。

1.4病菌的分離純化

無菌檢測采用病亡水貂肝部、肝臟、心血管，于潔凈臺中注射于H.E.瓊脂粉培養(yǎng)液，放置37℃恒溫培養(yǎng)箱中塑造18—24h，挑菌黑綠色且核心有小黑點的菌體再次于H.E.培養(yǎng)液中劃線提純塑造18—24h，挑菌合乎以上特點的單菌體注射于LB培養(yǎng)基中，放置37℃振蕩培養(yǎng)箱塑造18—24h。

1.五分離菌的革蘭氏染色

挑菌提純后的單菌體開展革蘭氏染色，上色實際操作依照實驗試劑使用說明開展，上色后在顯微鏡下觀查病菌的上色特點和形狀。

1.六分離菌的生物化學(xué)評定

生物化學(xué)評定實驗參考ID32E腸桿菌科和其它非苛養(yǎng)革蘭氏陽性菌呈陰性鏈球菌評定實驗試劑條開展，用ATB全自動生物化學(xué)評定對系統(tǒng)結(jié)果判斷。

1.7分離出來菌的16SrDNA評定

依照病菌DNA基因獲取檢測試劑盒使用說明獲取分離出來菌的DNA做為PCR模版。PCR管理體系為：上、中下游引物設(shè)計和模版各1μL，ddH2O22μL，2×TaqMasterMix25μL，總?cè)莘e為50μL。PCR擴增反映程序流程為：94℃預(yù)轉(zhuǎn)性5min；94℃轉(zhuǎn)性30s，55℃淬火30s，72℃拓寬60s，共30個循環(huán)系統(tǒng)；72℃拓寬10min。用膠回收利用檢測試劑盒回收利用1500bp上下雜帶，回收利用物質(zhì)聯(lián)接pMD19-T媒介并轉(zhuǎn)到DH5α感受態(tài)細胞，施膠于帶有氨芐青霉素的LB瓊脂粉培養(yǎng)液塑造，挑菌陽性菌落放置含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中繁衍塑造，送上海生工生物技術(shù)企業(yè)轉(zhuǎn)錄組測序。轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果在NCBI的BLAST系統(tǒng)分區(qū)查找并核對剖析。

1.8分離出來菌的高致病實驗

論文參考文獻中的使用量與方式，每棵分離出來菌各自感柒5只小白鼠，每只小白鼠腹部注入0.2mL用高壓滅菌后的PBS調(diào)節(jié)濃度值后的菌液(濃度值1×108cfu/mL)，設(shè)定對照實驗一組，每只小白鼠注入0.2mL的無菌檢測PBS，其他標準與分離出來菌感柒組同樣。觀查并紀錄小白鼠身亡病發(fā)狀況。

1.9分離出來菌的藥品敏感實驗

依照英國臨床醫(yī)學(xué)和實驗室規(guī)范研究會(ClinicalandLaboratoryStandardsInstitute，CLSI)規(guī)范的操作方法和判準，選用KB紙條法檢驗分離出來菌對β-內(nèi)酰胺類(氨芐西林、頭孢曲松鈉、阿莫西林膠囊)，氨基糖苷類(阿米卡星、新霉素、卡那霉素)，四環(huán)素類(鹽酸多西環(huán)素、土霉素)，氟喹諾酮類(環(huán)丙沙星、恩諾沙星)，氯霉素類(氟苯尼考)，大環(huán)內(nèi)酯(替米考星)，磺胺類(磺胺間甲氧、磺胺二甲氧、復(fù)方新諾明)，總共15種抗菌素的敏感度。

2結(jié)果

2.1病菌的分離純化

從65份樣本中總共分離出來出9株疑是沙門菌的菌種。疑是菌種在H.E.瓊脂粉培養(yǎng)液塑造菌體正圓形，邊沿齊整，微突，深藍色，菌體正中間有小黑點(圖1A)。

2.2分離菌的革蘭氏染色

經(jīng)革蘭氏染色，9株分離出來菌均為革蘭氏陽性菌呈陰性短鏈球菌，兩邊鈍圓(圖1B)。