細(xì)菌黑色素是天然色素的主要來源于，具備與眾不同的制造優(yōu)點和生物活性，關(guān)鍵有紅、黃、藍(lán)三大色調(diào)。相對性于鮮紅色黑色素，細(xì)菌淡黃色黑色素的類型較少，但在食品類、護(hù)膚品等領(lǐng)域有著廣泛的行業(yè)前景?，F(xiàn)階段已發(fā)覺產(chǎn)淡黃色黑色素的細(xì)菌關(guān)鍵有(1)紅曲霉屬(Monascusspp)造成萘醌類紅曲黃色素，并已商業(yè)化的生產(chǎn)制造；(2)曲霉屬(Aspergillus)A．cristatus和A．xavus造成甲基萘醌類黃色素；(3)青霉屬Penicilliumcitreonigrum造成黃色素；(4)散囊菌屬Eurotiumrubrum代謝萘醌類黃棕色黑色素。而Simplicillium屬細(xì)菌造成的黑色素則末見報導(dǎo)。

本試驗室從藍(lán)藻細(xì)胞培養(yǎng)液中分離出來出一株相互依存細(xì)菌Simpliciiliumlanosoniveum(DT06)。該細(xì)菌在沙氏培養(yǎng)液中生成一種新的抗菌素、胞外含糖量和少量的黑色素，而在含碳量無機(jī)物培養(yǎng)液中則很多生成黃色素(DT06黑色素)，這也是第一次發(fā)覺Simplicillium屬的細(xì)菌可以生成黑色素。文中對DT06黑色素開展分離純化、表現(xiàn)，科學(xué)研究其抗氧化和可靠性，并選用Plackett—Burman和響應(yīng)面設(shè)計方案，對其發(fā)醇培養(yǎng)液成份開展提升，為該黑色素的進(jìn)一步運(yùn)用打下基礎(chǔ)。

一、原材料與方式

1、原材料

（1）菌苗與培養(yǎng)液

細(xì)菌DT06(Simplicilliumlanosoniveum)由河北工業(yè)高校代謝工程試驗室分離出來，現(xiàn)儲藏在中科院微生物菌種研究室菌物標(biāo)本館，儲藏序號HMAS242045。PDA培養(yǎng)液(1L)：土豆200g，葡萄糖水20g，瓊脂粉15g，pH當(dāng)然。

改進(jìn)BG-11培養(yǎng)液(1L)：NaNO₃0.76g，K₂HP0₄0.48g，MgS0₄·7H₂0O.075g，CaCl₂·2H₂00.036g，葡萄糖水18g，Criticacidstock(CS)10mL，Tracemetalmix(TM)lmL，pH當(dāng)然。

（2）原材料、儀器設(shè)備與機(jī)器設(shè)備

2，2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二氨鹽(ABTS)、1，1-二苯基-2-三磺酰氯肼(DPPH)：南京市奧多福尼生物技術(shù)有限責(zé)任公司；別的分析純化工品均購自南開大學(xué)科威企業(yè)。

Agilent-1200高效率液相色譜：英國Agilent企業(yè)；CARy300型紫外線光譜儀：上海精科儀器廠；RE-5205旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海亞榮生物化學(xué)儀器廠。

2、方式

（1）發(fā)醇方式

將4℃儲藏的細(xì)菌DT06注射于PDA斜坡培養(yǎng)液上，25℃塑造5d，無菌檢測情況下配置成胞子混液，注射于100／250mLBG-11培養(yǎng)液中，在25℃、130r／min標(biāo)準(zhǔn)下?lián)u床塑造36h做成種籽液，以l％的接種量把種籽液接轉(zhuǎn)到80／250mL改進(jìn)BG-11培養(yǎng)液中，在同樣情況下?lián)u床塑造7d。

（2）黑色素的剝離與提純

將發(fā)酵物在8000r／min標(biāo)準(zhǔn)下離心式10min，去除菌絲，搜集上清液。500mL上清液中添加300mL硫酸堿化的乙酸丁酯，充足波動，靜放取頂層乙酸丁酯提取液。滲瀝液低電壓水蒸氣蒸餾去除乙酸丁酯，獲得的黑色素用工業(yè)甲醇融解，再用0．22μm濾紙過慮，獲得高純工業(yè)甲醇黑色素水溶液。

（3）黑色素的色譜及成分計算方式

將獲得的高純黑色素水溶液用適當(dāng)工業(yè)甲醇稀釋液，用紫外線-由此可見光度計開展全股票波段掃描儀(200～800nm)，以明確較大消化吸收光波長。

選用Agilent-1200高效率液相色譜開展剖析，色譜儀標(biāo)準(zhǔn)：C18(Kromasil)離子交換柱(250mm×4．6mm，5μm)；進(jìn)樣量：20μL；柱溫：25℃，紫外線-能見光探測器。在以上情況下檢驗DT06黑色素的最好流動性相及流動速度。

在色素沉著的最高消化吸收光波長下，用OD值值表明黑色素成分，黑色素成分表明為較大消化吸收光波長下1ml回應(yīng)發(fā)酵物的OD值值。

（4）黑色素的清除自由基活力

各自測量細(xì)菌DT06黑色素對DPPH氧自由基、ABTS氧自由基、超氧自由基和羥基自由基的清理工作能力。DPPH氧自由基、ABTS氧自由基和超氧自由基的清除率計算方法為：[1-(A₁-A₂)／A₀]×100；羥基自由基清除率計算方法為：(A₁-A₀)／(A₂-A₀)×100，在其中A₁、A₂和A₀各自為對照組、對照實驗和空缺組的吸光度值。同樣情況下，用等濃度值的維他命C做陽性對照。

（5）黑色素的可靠性

各自取一定量的黑色素水溶液于具塞試管嬰兒中，科學(xué)研究不一樣溫度(4、20、40、60、80、100℃)、陽光照射(黑喑、陽光照射、紫外線、12000LX)、pH(2、4、6、8、10)對其穩(wěn)定的危害，每24h抽樣一次，用280nm處的OD值值表明黑色素成分。

（6）培養(yǎng)液各成分的提升

在BG-11培養(yǎng)液的根基上，運(yùn)用Plackett-Burman(PB)試驗設(shè)計，科學(xué)研究葡萄糖水(X₁)、NaN0₃(X₂)、K₂HP0₄(X₃)、MgS0₄·7H₂0(X₄)、CaCl₂‘2H₂0(X₅)、CS(X₆)、TM(X₇)對細(xì)菌DT06生產(chǎn)制造黑色素(Y)的危害，在PB實驗方案設(shè)計結(jié)果的根基上，用Box-Behnken設(shè)計方案(BBD)開展響應(yīng)面提升。

二、結(jié)果與探討

1、黑色素的色譜

堿化的乙酸丁酯提取液經(jīng)蒸餾、工業(yè)甲醇復(fù)溶獲得高純黑色素水溶液，呈淡黃色(圖1)。DT06黑色素能溶解于水，有別于A．cristatus產(chǎn)的黃色素。黑色素甲醇溶液的紫外線由此可見掃描儀光譜儀如圖所示2a所顯示，在285nm上有特點消化吸收峰，與P．citreonigrum和E．rubrum黃色素各自在330nm和396nm處的特點消化吸收峰不一樣，285nm能夠 做為檢驗光波長用以高效液相色譜色譜和黑色素成分測量。
 

依據(jù)著色劑的正負(fù)和離子交換柱的類型來挑選適宜的流動性相和流動速度，最后明確當(dāng)流動性相為乙腈：水(2:8，V/V)、流動速度為0.8mL／min時離子交換柱對黑色素的分離出來實際效果最好是，如圖所示2b所顯示，在10.52min上下發(fā)生單一峰(7.84min為工業(yè)甲醇有機(jī)溶劑峰)，峰形險峻、對稱優(yōu)良，說明黑色素純凈度較高。