香菜為葉菜，其表層微生物菌種總數(shù)多，類型繁雜。微生物菌種的浸染不但會(huì)危害香菜的外型，本質(zhì)上也減少了服用使用價(jià)值，降低貨架期時(shí)間”。香菜栽種的土壤層、氣侯等自然環(huán)境情況不一樣，伴隨著栽培技術(shù)的提升與標(biāo)準(zhǔn)的擴(kuò)張，現(xiàn)切生產(chǎn)加工經(jīng)營(yíng)規(guī)模的不斷發(fā)展，從農(nóng)田到餐桌椅的階段增加，這種都提升了現(xiàn)切香菜微生物菌種環(huán)境污染的風(fēng)險(xiǎn)性，也增多了微生物菌種操縱的難度系數(shù)。

氫氧化鈣、氫氣、次氯酸鈣等能在水中造成次氯酸鈉的農(nóng)藥殺菌劑總稱之為有效氯農(nóng)藥殺菌劑，在其中次氯酸鈉是現(xiàn)階段使用最普遍的有效氯農(nóng)藥殺菌劑。此農(nóng)藥殺菌劑以氯為主導(dǎo)，在溶液中產(chǎn)生有強(qiáng)氧化性的次氯酸鈉，次氯酸鈉穿透微生物菌種的細(xì)胞質(zhì)進(jìn)入體細(xì)胞，與胞內(nèi)蛋白質(zhì)造成鈦酸異丙酯反映進(jìn)而凝結(jié)細(xì)胞液，可高效殺掉病菌，實(shí)際效果顯著且反應(yīng)靈敏。現(xiàn)階段，許多公司具體應(yīng)用氫氧化鈣做為農(nóng)藥殺菌劑，并關(guān)鍵檢測(cè)菌落總數(shù)與大腸桿菌的調(diào)節(jié)狀況。因?yàn)闅溲趸}很有可能存有氯殘余而對(duì)身體健康造成傷害嘲，因而必須 擴(kuò)大翠綠色可靠的農(nóng)藥殺菌劑類型，持續(xù)發(fā)掘新的農(nóng)藥殺菌劑并嚴(yán)控其應(yīng)用濃度值。

次氯酸鈉溶液是一種酸堿性氧化劑，可溶強(qiáng)電解質(zhì)、酒精、醫(yī)用乙醚、鹽酸等有機(jī)溶劑，有很強(qiáng)的刺激怪味，對(duì)人的雙眼、肌膚、粘膜和呼吸道有刺激效果，特性不穩(wěn)定，受熱或有機(jī)化合物、金屬離子、強(qiáng)酸等易溶解。

次氯酸鈉溶液可消滅細(xì)菌繁殖體、細(xì)菌、病毒感染、分枝桿菌、細(xì)菌芽孢等微生物菌種，且在較低溫度下仍合理，其滅菌實(shí)際效果受濃度值、溫度、空氣濕度、有機(jī)化合物等要素危害網(wǎng)。次氯酸鈉溶液在濃度值為50mg/1下就能實(shí)現(xiàn)較好的滅菌實(shí)際效果，基本上對(duì)全部現(xiàn)切蔬菜水果表層的腐壞菌和病原菌有顯著抑止實(shí)際效果，但因其穿透性不強(qiáng)，較低濃度的下雖對(duì)飄浮的微生物菌種實(shí)際效果顯著，而對(duì)牢牢地吸咐在現(xiàn)切商品表層的生物功效不顯著嘲。次氯酸鈉溶液反映的副產(chǎn)品是水和O2，對(duì)身體和自然環(huán)境無毒性沒害，因而被覺得是一種環(huán)保節(jié)能的農(nóng)藥殺菌劑，F(xiàn)DA已經(jīng)將其列入非清洗食品類觸碰表層消毒殺菌劑。次氯酸鈉溶液做為氯系農(nóng)藥殺菌劑的代替品，在現(xiàn)切蔬菜水果生產(chǎn)加工中獲得普遍科學(xué)研究與運(yùn)用。

與含氯制劑對(duì)比，二氧化氯不容易與有機(jī)化合物反映轉(zhuǎn)化成致癌物質(zhì)、致基因突變、胎兒畸形的化學(xué)物質(zhì)，是現(xiàn)在世界上認(rèn)可。的全新一代高效率、廣譜性、安全性的除菌防腐劑同。它能快速空氣氧化病毒蛋白質(zhì)衣殼中的色氨酸，抑止疫情的非特異吸咐，阻攔其對(duì)靶細(xì)胞的浸染，還能與病菌以及他微生物菌種蛋白中的一部分碳水化合物產(chǎn)生氧化還原反應(yīng)反映，溶解毀壞碳水化合物，抑止微生物菌種蛋白質(zhì)合成，進(jìn)而造成 微生物菌種身亡。很多歐洲國(guó)家相關(guān)機(jī)構(gòu)已許可和強(qiáng)烈推薦二氧化氯用以食物的消毒殺菌、防腐蝕、冷藏等，世衛(wèi)組織(WH0)已將二氧化氯列入A1級(jí)安全性高效消毒劑，在我國(guó)衛(wèi)生計(jì)生委也已準(zhǔn)許二氧化氯為消毒液和新式食用添加劑。

以上3種減菌劑在現(xiàn)切香菜中的減菌實(shí)際效果還欠缺科學(xué)研究，因而創(chuàng)作者選用氫氧化鈣、二氧化氯和次氯酸鈉溶液解決現(xiàn)切香菜，明確合適于現(xiàn)切蕪荽的最好減菌劑，根據(jù)16SrDNA全基因組測(cè)序技術(shù)檢查鑒定現(xiàn)切香菜表層細(xì)菌種類，剖析關(guān)鍵發(fā)病與致腐病菌，以求更合理地提升現(xiàn)切香菜商品的安全系數(shù)。

1 原材料與方式

1.1 實(shí)驗(yàn)原材料

香菜：市面上。

1.2 關(guān)鍵實(shí)驗(yàn)試劑及儀器設(shè)備

1.2.1 關(guān)鍵實(shí)驗(yàn)試劑

氫氧化鈣、二氧化氯、次氯酸鈉溶液、氧化鈉、胰蛋白胨、酵母浸膏、葡萄糖水、瓊脂粉、乳清蛋白、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、月桂酸硝酸鈉、煌綠乳清蛋白膽鹽骨頭湯培養(yǎng)液、氫氧化鈉溶液、硫酸、酒精、牛肉膏、蛋白胨、結(jié)晶紫、草酸銨、碘片、碘酸鉀、番紅、松柏樹油、SK1201-UN10-10立柱式病菌基因DNA抽提檢測(cè)試劑盒等。

1.2.2 關(guān)鍵儀器設(shè)備

DJ300高精密電子分析天平：北京市賽多利斯儀器設(shè)備系統(tǒng)軟件有限責(zé)任公司商品；YXQ-SG41-280手提工作壓力蒸汽滅菌鍋：上海市華線醫(yī)療反物質(zhì)儀器設(shè)備有限責(zé)任公司商品：SW-CJ-1FD凈化工作臺(tái)：蘇凈集團(tuán)蘇州市萬通氣體技術(shù)性有限責(zé)任公司商品；GRP-9160型防水防火式恒溫培養(yǎng)箱：上海森信實(shí)驗(yàn)室儀器有限責(zé)任公司商品；XW-80A小型漩渦混和儀：上海市滬西剖析儀器廠有限責(zé)任公司商品：HH-6數(shù)顯式恒溫水浴鍋：常州市國(guó)華家用電器有限責(zé)任公司商品：SPX-320型智能化生化培養(yǎng)箱：寧波市江南地區(qū)儀器廠商品；PCR反映增加儀：澳大利亞BBI企業(yè)商品：3730轉(zhuǎn)錄組測(cè)序檢測(cè)儀：美罔ABI企業(yè)商品；H6-1小型電泳槽：上海市精益求精有機(jī)玻璃板產(chǎn)品儀器廠商品；凝膠成像系統(tǒng)軟件：GeneGenius企業(yè)商品。

1.3 實(shí)驗(yàn)方式

1.3.1 試品及減菌劑的提前準(zhǔn)備

選擇無枯黃、無機(jī)械設(shè)備傷、無病害、新鮮程度基本一致的當(dāng)?shù)噩F(xiàn)切香菜，去根，冷水洗至可立即服用，晾曬至無水跡，備用。

氫氧化鈣(5.2mg/1)配置成濃度值為0、50、100、150、200、250mg/1的水溶液，測(cè)量pH各自為6.32、10.33、11.37、11.70、11.90、12.07。

二氧化氯(8mg/1)配置成濃度值為0、20、40、60、80、100mg/1的水溶液，測(cè)量pH各自為5.90、3.16、2.87、2.73、2.56、2.41。

次氯酸鈉溶液(15.7mg/1)，由A液(醋酸和鹽酸)和B液(雙氧水)以容積比10:8制取1000mg/1水溶液，反映24h后稀釋液成0、50、100、150、200、250mg/1，測(cè)量PH各自為6.93、4.79、4.03、3.78、3.60、3.52。
1.3.23種減菌劑解決

較為3種減菌劑減菌實(shí)際效果，挑選實(shí)際效果最好的減菌劑，以提升減菌劑解決主要參數(shù)。3種減菌劑解決標(biāo)準(zhǔn)見表1。全部解決在常溫下開展，每一個(gè)解決反復(fù)3次。

1.3.3 二氧化氯正交和解決

依照1₉(3⁴)正交表，對(duì)解決濃度值(20、40、60mg/1)、解決時(shí)間(2、5、10min)、水菜容積質(zhì)量比(4m1:1g、8m1:1g、12m1:1g)三要素開展正交實(shí)驗(yàn)，對(duì)照實(shí)驗(yàn)為冷水洗前及冷水洗后備用的試品。正交試驗(yàn)表見表2。

1.4 測(cè)量指標(biāo)值與方式

1.4.1 菌落總數(shù)

參考GB/T4789.2-2016。

1.4.2 大腸桿菌

參考GB/T4789.3-2016。

1.5 病菌的分離純化與儲(chǔ)藏

無菌檢測(cè)自然環(huán)境下，稱量25g現(xiàn)切香菜置盛有225m1無菌檢測(cè)鹽水的錐形瓶中，放置搖床80r/min，搖晃20min，馬上將試品液稀釋液至1×10^-3、1×10^-1、1×10^-5二三個(gè)梯度方向，汲取1m1試品勻液于無菌檢測(cè)培養(yǎng)皿內(nèi)，每一個(gè)稀釋液度做兩個(gè)反復(fù)與此同時(shí)，各自汲取1m1無菌檢測(cè)鹽水添加兩個(gè)無菌檢測(cè)培養(yǎng)皿內(nèi)作空白試驗(yàn)。立即將牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)液竭盡培養(yǎng)皿，并旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)皿使其混和勻稱。于(36±1)℃顛倒控溫塑造(48±2)h。實(shí)驗(yàn)反復(fù)3次、觀查病菌的成長(zhǎng)狀況及菌體的顏色和特點(diǎn)，并選擇優(yōu)點(diǎn)菌挑菌單菌體，選用平板劃線法于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)液畫線提純。于(36±1)℃顛倒控溫塑造(48±2)h。持續(xù)提純5代。

挑菌提純第5代的單菌體注射于牛肉膏蛋白胨斜坡，于(36±1)℃顛倒控溫塑造(24±2)h。放置4℃冰柜中儲(chǔ)藏。

1.6 病菌形狀觀查

1.6.1 簡(jiǎn)落形狀觀祭

觀查提純第5代平皿內(nèi)菌體尺寸、菌體形狀、菌體色調(diào)、菌體表層特點(diǎn)(光潔是否、干躁是否、是不是突起、是不是全透明、是不是存有同舟環(huán)等)、邊沿標(biāo)準(zhǔn)是否。

1.6.2 革蘭氏染色

參考CB/T4789.28-2013。

1.7 16SrDNA序列的剖析以及系統(tǒng)發(fā)育樹的創(chuàng)建

1.7.1 DNA獲取

參考上海生工SK1201-UNIQ-10立柱式病菌基兇組DNA抽提檢測(cè)試劑盒使用說明書實(shí)際操作。

1.7.2 PCR擴(kuò)增病菌的16SrDNA序列

1) 引物設(shè)計(jì)編碼序列

正方向引物設(shè)計(jì)27F：5’-AGACTTTCATCCTGGCTCAG-37；反方向引物設(shè)計(jì)1492R(1510)：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’。

2) PCR反映管理體系創(chuàng)建(50μ1)

模版DNA10pmo1，上游引物1μ1，中下游引物設(shè)計(jì)1μ1，dNTPMix1μ1，10×TaqreactionBuffer5μ1，高保真音響聚合酶(5U/μ1)0.25μ1，無菌檢測(cè)超純水系統(tǒng)補(bǔ)充至50μ1。

3) PCR程序流程設(shè)置

98℃預(yù)轉(zhuǎn)性5min：95℃轉(zhuǎn)性35s，55℃淬火35s，72℃拓寬90s，3五個(gè)循環(huán)系統(tǒng)；拓寬8min。

1.8 屬種評(píng)定

將PCR物質(zhì)送至轉(zhuǎn)錄組測(cè)序企業(yè)開展轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。將轉(zhuǎn)錄組測(cè)序進(jìn)行的16SrDNA序列在GenBank(NCBI)中開展B1AST查找，找尋類似編碼序列并免費(fèi)下載，用MEGA制作軟件系統(tǒng)發(fā)育樹明確病菌屬種。

1.9 數(shù)據(jù)處理方法

數(shù)據(jù)信息取3次反復(fù)均值，選用Exce1、SPSS18.0、正交設(shè)計(jì)小助手等手機(jī)軟件對(duì)信息開展剖析。