近日，?華東理工大學(xué)生物反應(yīng)器工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室李志敏教授課題組在酶工程方向取得新進(jìn)展，有關(guān)成果在Chemical Engineering Journal以“Iterativeconformational dynamics-guided protein engineering reshapes biocatalystproperties for efficient and cost-effective cytidine 5\’-monophosphateproduction” （https://doi.org/10.1016/j.cej.2021.131597）為題進(jìn)行了報(bào)道。
基于分子-構(gòu)象動(dòng)力學(xué)模擬的虛擬篩選結(jié)合濕法實(shí)驗(yàn)是獲得目標(biāo)蛋白質(zhì)的一種有吸引力的方法。然而，傳統(tǒng)的構(gòu)象動(dòng)力學(xué)可能無法最大程度地篩選影響酶性能的關(guān)鍵殘基，導(dǎo)致蛋白質(zhì)改造成功率低。為了獲得盡可能多且可靠性高的關(guān)鍵殘基，作者提出了一種迭代構(gòu)象動(dòng)力學(xué)分析（ICDA）策略。ICDA不僅考慮溫度對(duì)蛋白整體的影響，而且還結(jié)合殘基之間相互作用，可提高突變文庫質(zhì)量。
作者前期構(gòu)建了嗜極酶耦聯(lián)生產(chǎn)胞苷酸體系（Li et al. J. Agr. FoodChem. 2020），基于該體系驗(yàn)證了ICDA方法。通過多代丙氨酸掃描和動(dòng)力學(xué)模擬，快速確定了體系中胞苷激酶的24個(gè)核心殘基。在模擬結(jié)果的指導(dǎo)下，進(jìn)一步選擇了5個(gè)殘基進(jìn)行深入分析，得到2個(gè)關(guān)鍵殘基（A220和A248）和15個(gè)突變，并通過實(shí)驗(yàn)和計(jì)算評(píng)估所有突變體。其中A220L變體催化底物胞苷的活性增加了7.3倍，A248S的kcat/Km增加了3.5倍。兩個(gè)變體均可替換野生型胞苷激酶，通過嗜極酶耦聯(lián)體系在5小時(shí)內(nèi)將400 mM胞苷完全轉(zhuǎn)化為胞苷酸，平均生產(chǎn)速率較原始水平提高了4倍。
為了證明ICDA的普遍適用性，作者還研究了耦聯(lián)體系中的多聚磷酸激酶，通過對(duì)多聚磷酸激酶執(zhí)行ICDA分析，快速確定了17個(gè)關(guān)鍵殘基，并選擇其中三個(gè)殘基（E40、V72和A98）進(jìn)行飽和突變，得到57個(gè)突變體。選擇10個(gè)均方根波動(dòng)發(fā)生顯著變化的多聚磷酸激酶突變體用于全細(xì)胞催化實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，V72T變體可催化三聚磷酸鹽和ADP生成ATP的反應(yīng)。使用多聚磷酸激酶變體與胞苷激酶變體耦聯(lián)，不僅提高了胞苷酸的生產(chǎn)效率，而且降低了成本。這些結(jié)果有力地支持了ICDA方法的適用性。相關(guān)研究結(jié)果均已申請(qǐng)專利（專利申請(qǐng)?zhí)?02110403969.3和202110404992.4）。
上述論文第一作者為我校生物工程學(xué)院在讀博士生李宗霖，通訊作者為李志敏教授。研究工作得到了天津市合成生物技術(shù)創(chuàng)新能力提升項(xiàng)目（TSBICIP-KJGG-009）和國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2019YFA0904300）資助。
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