小麥胚芽是小麥制粉過程中的主要副產(chǎn)物，營養(yǎng)價(jià)值豐富，其中高含量的蛋白質(zhì)以及不飽和脂肪酸讓小麥胚芽可作為蛋白補(bǔ)充劑與糧油制品的理想原料。但由于小麥胚芽中存在高活性的內(nèi)源脂肪氧化酶、高含量的抗?fàn)I養(yǎng)因子以及高水分活度，使得小麥胚芽難以直接作為食品加工原料得到有效利用，往往被作為飼料或廢料處理。發(fā) 酵作為改良食品理化及加工特性的有效方法，在小麥胚芽上也得到了成功應(yīng)用。發(fā)酵后的小麥胚芽中的植酸等抗?fàn)I養(yǎng)因子的含量大大減少，脂肪酶和脂肪氧化酶的活性也得到顯著抑制。研究還發(fā)現(xiàn)，小麥胚芽中的活性肽、多酚等功能活性物質(zhì)的含量也在發(fā)酵后顯著增加，具有降血脂、抗氧化、抗腫瘤等生理功能]。其中2,6-二甲氧基對(duì)苯醌（2,6-dimethoxy-ρ-benzoquinone，2,6-DMBQ）作為發(fā)酵小麥胚芽中主要的抗腫瘤活性成分而受到廣泛關(guān)注。

2,6-DMBQ來源于小麥胚芽細(xì)胞內(nèi)的水溶性氫醌糖苷。在發(fā)酵過程中，氫醌糖苷的糖苷鍵受微生物分泌的β-葡萄糖苷酶的作用斷裂，并在過氧化氫酶的作用下生成2,6-DMBQ[13]。HIDV魪GI M等[14]在20世紀(jì)90年代利用面包酵母發(fā)酵小麥胚芽，對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物加工后得到發(fā)酵小麥胚芽提取物并命名為Avemar。在后續(xù)的研究中，Avemar的抗腫瘤、抗氧化、提高免疫力的功效得到廣泛證實(shí)，但對(duì)于Avemar具體的發(fā)酵工藝與發(fā)酵菌種卻鮮有報(bào)道。國內(nèi)學(xué)者經(jīng)秀等]和國外學(xué)者RIZZELLO C G等[18]分別以酵母菌和乳酸菌為受試菌種進(jìn)行產(chǎn)2,6-DMBQ菌種的篩選，最終得出高溫釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和植物乳桿
菌（Lactobacillus plantarum）為最適發(fā)酵菌種，但是后續(xù)并沒有對(duì)兩種菌種產(chǎn)2,6-DMBQ的能力進(jìn)行進(jìn)一步比較。

本研究以小麥胚芽為原料，2,6-DMBQ產(chǎn)量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，從3株菌株中篩選最優(yōu)發(fā)酵菌種，并考察3種原料前處理方式對(duì)2,6-DMBQ產(chǎn)量的影響。在此基礎(chǔ)上，探究菌種添加量、料液比、發(fā)酵溫度以及發(fā)酵時(shí)間4個(gè)發(fā)酵工藝因素對(duì)2,6-DMBQ產(chǎn)量的影響，并通過單因素試驗(yàn)及正交試驗(yàn)確定最適合發(fā)酵工藝組合，旨在為發(fā)酵小麥胚芽資源進(jìn)一步開發(fā)利用提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料

小麥胚芽：市售。

1.1.2 菌種

植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）：實(shí)驗(yàn)室分離保存；高溫釀酒酵母（Saccharomycescerevisiae）、低糖面包酵母：安琪酵母股份有限公司。

1.1.3 試劑

甲醇、氯化鈉（均為分析純）：國藥集團(tuán)上海試劑有限公司；2,6-二甲氧基對(duì)苯醌標(biāo)準(zhǔn)品（純度>97%）：梯希愛上海化成工業(yè)發(fā)展有限公司；酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YEPD）培養(yǎng)基、孟加拉紅培養(yǎng)基、MRS肉湯培養(yǎng)基、MRS固體培養(yǎng)基：廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

RS-FS1401型多功能粉碎機(jī)：合肥榮事達(dá)小家電有限公司；LHS-250HC-11型恒溫恒濕培養(yǎng)箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；BSA 124S型精密分析天平：廣州市授科儀器科技有限公司；Avanti J-26xp型高速離心機(jī)：美國Beckman公司；DHG-9053A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；KQ-700DE型數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；LDZM-80L-III型滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠；LGJ-25G冷凍干燥機(jī)：北京四環(huán)福瑞科儀科技發(fā)展有限公司；M3-L233B微波爐：廣東美的微波爐制造有限公司；Waters ACQUITY UPLC H-CLASS超高效液相色譜系統(tǒng)：美國Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 小麥胚芽發(fā)酵工藝及操作要點(diǎn)

? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?菌種活化
? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?↓
小麥胚芽→粉碎→滅菌→預(yù)處理→接種→發(fā)酵

操作要點(diǎn)：

粉碎：將小麥胚芽粉碎后，過60目篩。滅菌：將小麥胚芽粉與超純水按質(zhì)量比1∶3充分混勻后在121 ℃條件下高壓蒸汽滅菌15 min。預(yù)處理：將滅完菌的小麥胚芽與超純水按照質(zhì)量比1∶10再次混勻，按照后續(xù)試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行不同處理。菌種活化、接種：將植物乳桿菌接入MRS肉湯，37 ℃條件下培養(yǎng)24 h，取200 μL培養(yǎng)液接入MRS肉湯培養(yǎng)基，37 ℃條件下培養(yǎng)24 h，連續(xù)活化培養(yǎng)2代后，按后續(xù)試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行接種。高溫釀酒酵母和低糖面包酵母在37 ℃溫水中活化10 min后取200 μL接入YEPD培養(yǎng)基，28 ℃條件下培養(yǎng)24 h，連續(xù)活化培養(yǎng)2代后，按后續(xù)試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行接種。發(fā)酵：按照后續(xù)試驗(yàn)設(shè)計(jì)分別在不同條件下進(jìn)行發(fā)酵。

1.3.2 發(fā)酵菌種的篩選

植物乳桿菌：用無菌生理鹽水將活化后的植物乳桿菌菌體濃度調(diào)節(jié)至1×10⁴ CFU/mL，按菌種添加量1∶6（菌液與麥胚質(zhì)量比，g∶g）添加到料液比為1∶15（麥胚與水質(zhì)量比，g∶g）的小麥胚芽發(fā)酵基液中，37 ℃條件下發(fā)酵24 h。

酵母：用無菌生理鹽水將活化后的高溫釀酒酵母、低糖面包酵母的菌體濃度調(diào)節(jié)至1×10⁴ CFU/mL，按菌種添加量1∶6分別添加到料液比為1∶15的小麥胚芽發(fā)酵基液中，28 ℃條件下發(fā)酵24 h。

?取發(fā)酵液測定2,6-DMBQ產(chǎn)量，比較3株菌產(chǎn)2,6-DMBQ的能力，確定最適發(fā)酵菌種。

1.3.3 不同預(yù)處理方式對(duì)2,6-DMBQ產(chǎn)量的影響

在確定最適發(fā)酵菌種的基礎(chǔ)上，以未作處理的小麥胚芽為空白對(duì)照，根據(jù)前期預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，分別采用高溫（95 ℃，30 min）、微波（700 W，5 min）、超聲（功率100%，30 min）3種方法對(duì)小麥胚芽進(jìn)行預(yù)處理。用無菌生理鹽水將活化后的最適菌種的菌體濃度調(diào)節(jié)至1×104 CFU/mL，按菌種添加量1∶6添加到料液比為1∶15的小麥胚芽發(fā)酵基液中，28 ℃條件下發(fā)酵24 h。測定發(fā)酵液中2,6-DMBQ產(chǎn)量，以探究不同的預(yù)處理?xiàng)l件下是否有助于2,6-DMBQ產(chǎn)量的增加，確定最適預(yù)處理方式。

1.3.4 發(fā)酵條件優(yōu)化單因素試驗(yàn)

在確定最適發(fā)酵菌種和預(yù)處理方式后進(jìn)行發(fā)酵條件的研究，固定發(fā)酵條件為：菌種添加量1∶6、料液比1∶15、發(fā)酵時(shí)間24 h、發(fā)酵溫度28 ℃，在此基礎(chǔ)上，依次考察菌種添加量（1∶2、1∶4、1∶6、1∶8、1∶10）、料液比（1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、 1∶25）、發(fā)酵溫度（18 ℃、23 ℃、28 ℃、33 ℃、38 ℃）、發(fā)酵時(shí)間（18 h、24 h、30 h、36 h、42 h）對(duì)2,6-DMBQ產(chǎn)量的影響，確定
各因素的最適條件以進(jìn)行正交試驗(yàn)。

1.3.5 發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以2,6-DMBQ產(chǎn)量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，選取菌種添加量（A）、料液比（B）、發(fā)酵時(shí)間（C）、發(fā)酵溫度（D）4個(gè)因素進(jìn)行4因素3水平的L（9 34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以確定最佳發(fā)酵條件組合，正交試驗(yàn)因素與水平見表1。

1.3.6 2,6-DMBQ產(chǎn)量的測定

樣品的處理：將發(fā)酵液在8 000×g、4℃條件下離心15 min，取上清液冷凍干燥，然后加入20 mL甲醇于凍干物料中進(jìn)行浸提，超聲處理（功率100%，30 min）后，用0.22 μm濾膜過濾制得待測樣品液進(jìn)行測定。

參照經(jīng)秀等[17]的方法進(jìn)行了改進(jìn)，采用超高效液相色譜（ultra performance liquidchromatography，UPLC）法測定2,6-DMBQ產(chǎn)量。UPLC條件：ACQUITY UPLC BEH C18色 譜柱（2.1 mm×100 mm1.7 μm），流動(dòng)相為甲醇∶水=20∶80（V/V），流速0.2 mL/min，柱溫35 ℃，進(jìn)樣量0.2 μL，檢測波長
288 nm。以2,6-DMBQ的質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，峰面積（y） 為縱坐標(biāo)，繪制2,6-DMBQ標(biāo)準(zhǔn)曲線。2,6-DMBQ標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為y=48 102x-33 772，R²=0.999 4，說明2,6-DMBQ在1～100 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，可用于2,6-DMBQ的定量。根據(jù)2,6-DMBQ標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間進(jìn)行定性。