甜葉菊（SteviarebaudianaBertoni）屬多年生長 菊科木本植物，原產(chǎn)地于非洲地區(qū)和墨西哥的高山草甸，尤其是南美洲巴拉圭東北部地區(qū)。甜葉菊中含有甜菊糖苷，被普遍作為純天然甜味素。有科學(xué)研究報導(dǎo)從甜菊提取液中評定出89種化學(xué)物質(zhì)，并將其劃分為多酚類、三萜類、碳水化合物化合物、油酸以及化合物類、低聚木糖、糖脂質(zhì)、漂呤和維甲酸等。這種化學(xué)物質(zhì)具備各種生物活性，如抗氧化性，抗菌，抗癌等。甜菊提取液中的花青素和黃酮類化合物、多糖類化學(xué)物質(zhì)具備較強的身體之外降低膽固醇的工作能力。殊不知，有關(guān)甜葉菊提取液身體抗氧化性活力的科學(xué)研究很少有報導(dǎo)。在生產(chǎn)制造甜菊糖苷的環(huán)節(jié)中會形成很多的斜板沉淀池廢料，在其中富含大量的的多酚類，而這種副產(chǎn)品并未獲得靈活運用。科學(xué)研究甜葉菊廢料提取液的抗氧化性、延緩衰老功效，對充足綜合利用甜葉菊資源有著關(guān)鍵實際意義。

本探討選用高效液相色譜色譜分析（HPLC）對二種甜葉菊廢料提取液中的主要成分開展定性分析，并檢測其對D-半乳糖致變老小白鼠血清蛋白、肝部和腦部中一些主要的抗氧化性指標(biāo)值（如超氧化物歧化酶（SOD）、硫辛酸乳酸脫氫酶（GPx）和丙二醛（MDA），及其腦部中Nrf2以及靶遺傳基因（SOD1，GPx1，HO-1）的mRNA表述能力的危害等，討論甜葉菊廢料提取液對D-半乳糖致變老小白鼠的抗氧化性功效，為其進(jìn)一步開發(fā)設(shè)計和使用給予理論來源。

一、原材料與方式

1、實驗原材料

二種甜葉菊廢料提取液，晨光生物高新科技控股集團有限責(zé)任公司。

2、動物實驗

SPF級昆明市種男性小白鼠（33～37g，SPF級，8周齡），軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動物實驗核心，小動物合格證書號：SCXK-（軍）2012-0004。

3、關(guān)鍵實驗試劑

D-半乳糖（分析純級），國藥控股化學(xué)藥品有限責(zé)任公司；茶氨酸（茶氨酸＞88%、EGCG＞40%、兒茶酸=0.76%），成都市華高生物制藥有限責(zé)任公司；咖啡酸、綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C、原兒茶醛、槲皮苷（純凈度均≧98%），成都市瑞芬斯生物技術(shù)有限責(zé)任公司；超氧化物歧化酶（SOD）、硫辛酸乳酸脫氫酶（GPx）、丙二醛（MDA）測定試劑盒，南京建成生物技術(shù)研究室；BCA法蛋白定量檢測試劑盒、高純度總RNA迅速獲取檢測試劑盒（離心式柱形），北京市百泰克生物科技有限責(zé)任公司；FastQuantcDNA第一鏈生成檢測試劑盒（去基因），天根生化高新科技（北京市）有限責(zé)任公司；工業(yè)甲醇（色譜儀級），北京市邁瑞達(dá)高新科技有限責(zé)任公司；其他實驗試劑均為國內(nèi)分析純級。

4、儀器設(shè)備與機器設(shè)備

Agilent1290超高效率液相色譜儀，英國安捷倫科技有限責(zé)任公司；DY89Ⅱ勻漿機，寧波新芝生物技術(shù)有限責(zé)任公司；SpectraMax13持續(xù)光波長多用途酶標(biāo)儀，英國MolecularDevices企業(yè)；3K15臺式離心機，法國Sigma企業(yè)；S1000PCR擴增儀、CFX96熒光定量PCR儀，英國伯樂相馬企業(yè)；NanoDropTM2000少量紫外線-能見光光度計，英國賽默飛世爾企業(yè)。

5、實驗方式

（1）二種甜葉菊廢料提取液中主要成分的定性分析

本試驗室分析工作人員早期科學(xué)研究確認(rèn)，甜葉菊廢料提取液的主要成分為咖啡酸、綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C、原兒茶醛和槲皮苷。選用HPLC法對二種甜葉菊廢料提取液中的主要成分開展定性分析。高效率液相色譜儀標(biāo)準(zhǔn)為：AgilentEclipsePlusC18色譜柱（50mm×2.1mm，1.8μm），流動性相為0.1%苯甲酸（A）和工業(yè)甲醇（B），流動速度0.1mL/min。過柱程序流程：0～10min，10%～50%（B）；10～12min，50%～10%（B）；12～15min，10%（B）。檢驗光波長320nm和360nm，柱溫30℃，進(jìn)樣量1μL。選用咖啡酸、綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C、原兒茶醛和槲皮苷為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，按以上色譜儀標(biāo)準(zhǔn)各自測量。以標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的質(zhì)量摩爾濃度為橫坐標(biāo)軸，峰總面積為縱軸，制作HPLC標(biāo)曲，并測量二種甜葉菊廢料提取液中各主要成分的成分。

（2）甜葉菊廢料提取液對D-半乳糖致變老小白鼠的抗氧化性功效

①小白鼠喂養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)

小白鼠喂養(yǎng)于北京食用添加劑工程設(shè)計研究所，自然通風(fēng)標(biāo)準(zhǔn)優(yōu)良，一切正常白天黑夜轉(zhuǎn)變（9:00-21:00），空氣濕度（40±5）%，室內(nèi)溫度（21±2）℃。

②試驗排序及實際操作

80只試驗小白鼠融入7d，喂養(yǎng)一般精飼料，隨意飲用水、尋食。穩(wěn)定期后，任意等分成一切正常組、D-半乳糖組、二種甜葉菊廢料提取液低、中、高使用量組（各自灌胃100，200，500mg/kgbw甜葉菊廢料提取液），每一組10只，與此同時用苦味酸對小白鼠開展序號。每組在灌胃的與此同時，D-半乳糖組和甜葉菊廢料提取液組，頸后背皮內(nèi)注射5%的D-半乳糖水溶液（500mg/kgbw），一切正常組注入等大小的鹽水。每日給藥1次，延遲時間為11周。

③被測樣版制取

試驗完成后，小白鼠忌食（禁不住水）11h。11h后，小白鼠摘目光采血，全血搜集于整潔的1.5mL離心管架中，37℃水浴15min，4000×g離心式15min分離出來血清蛋白，-80℃儲存被測。取血后，將小白鼠斷頸處決并解剖學(xué)，取下肝部和腦部并將其在急冷的鹽水中浸洗，除去血夜，用過濾紙吸走表層水份。將肝部和腦部一部分放進(jìn)小離心管架里，馬上放進(jìn)液態(tài)氮（-196℃）中冷凍，轉(zhuǎn)到超低溫冰箱（-80℃）儲放，預(yù)留。另一部分剪下來，添加9倍0.9%急冷的鹽水，置夾層玻璃勻漿器中冰水浴快速碾磨做成機構(gòu)勻漿，4℃，12000×g離心式15min，取上清液，-80℃儲存預(yù)留。

④血清蛋白及機構(gòu)抗氧化性指標(biāo)值的測量

測量血清蛋白、肝和腦部勻漿中SOD，GPx魅力及MDA成分，檢驗方式 具體步驟按檢測試劑盒表明開展。

⑤瑩光定量PCR檢驗小白鼠腦mRNA表述水準(zhǔn)

選用高純度總RNA迅速獲取檢測試劑盒獲取每組小白鼠腦部中總RNA，應(yīng)用NanoDropTM2000少量紫外線-能見光光度計檢驗其一致性以及濃度值。按逆轉(zhuǎn)錄檢測試劑盒操作指南，將獲取的RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA并放置-20℃儲存。根據(jù)SYBRGreen法開展熒光定量，反映管理體系以下（20μL）：無RNA酶水7.4μL，SuperRealPreMixPlus（SYBRGreen）10μL，上中下游引物設(shè)計各0.8μL，cDNA模版1μL。RT-PCR反映標(biāo)準(zhǔn)：94℃預(yù)轉(zhuǎn)性3min，94℃轉(zhuǎn)性30s，60℃淬火30s，72℃拓寬1min，40個循環(huán)系統(tǒng)。以β-actin為內(nèi)參基因開展即時瑩光定量PCR剖析。計算方式選用較為CT值法。涉及到的引物設(shè)計編碼序列見表1。

(3）數(shù)據(jù)信息數(shù)據(jù)分析

選用SPSS20.0統(tǒng)計分析軟件，實驗數(shù)據(jù)信息以平均值±相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（Mean±SD）表明，用單要素方差分析（one-wayANOVA）及多重比較（Duncan）開展差別顯著性分析，P＜0.05為差別明顯。

申明：文中常用照片、文本來源于《中國食品添加劑》，著作權(quán)歸原作全部。