食源性病原菌的破壞和繁衍是嚴(yán)重危害食品衛(wèi)生安全和公共健康的要素之一，變成大家重視的熱點(diǎn)話題。依據(jù)世衛(wèi)組織全新的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，全世界每一年有近十分之一的人因食品類環(huán)境污染而生病，近42萬人喪生于食源性疾病。食用添加劑做為增加食品類貨架期的一種方式，能夠抑止食源性病原菌的生長發(fā)育，殊不知食用添加劑潛在性傷害及添加物量變成顧客擔(dān)心的難題。與此同時(shí)，抗菌素做為關(guān)鍵抑止食源性疾病的根源藥品，其長期性亂用造成 食源性病原菌的耐藥難題越來越比較嚴(yán)重。鑒于此，科學(xué)研究工作人員持續(xù)找尋純天然的添加劑及其不容易造成耐藥的純天然抑菌化學(xué)物質(zhì)做為食用添加劑及抗菌素的代替品。

病菌素是病菌核糖體內(nèi)生成的一類具備抗菌活力的活性多肽或蛋白質(zhì)類化合物，關(guān)鍵對(duì)親緣關(guān)系較近的細(xì)菌有一定的抑制效果。病菌素具備高效率、無毒性、可靠性強(qiáng)、沒有殘留及其不容易形成耐藥性等優(yōu)勢(shì)，被廣泛認(rèn)為是抗菌素及有機(jī)化學(xué)防腐劑的替代品之一?，F(xiàn)階段真真正正用以商業(yè)化的的乳酸菌飲料病菌素僅有乳酸菌鏈球菌感染素（nisin）和片革蘭陰性桿菌素（pediocinPA1）。導(dǎo)致這個(gè)情況的因素主要是乳酸菌飲料病菌素的特性（如有一些乳酸菌飲料病菌素抗菌譜窄、pH敏感度及耐熱性差）和分離純化方式等眾多要素限定了乳酸菌飲料病菌素的獲得以及工業(yè)生產(chǎn)。挑選具備廣譜性殺菌作用，pH承受覆蓋面廣，耐熱性好的新式病菌素對(duì)食品衛(wèi)生安全具備關(guān)鍵實(shí)際意義。

枯草芽孢菌（Bacillussp.）做為動(dòng)物與植物和微生態(tài)制劑的優(yōu)點(diǎn)菌，不但類型多種多樣、可靠性強(qiáng)，并且普遍出現(xiàn)于大自然中。由枯草芽孢菌中蕨類枯草芽孢菌（B.licheniformis）、枯草枯草芽孢菌（B.subtilis）、凝固枯草芽孢菌（B.coagulans）等造成的病菌素也逐漸被關(guān)心和發(fā)覺。本分析從福建霞浦水域的杜蠣中分離出來出不一樣的病菌，并以普遍的食源性病原菌：橙黃色鏈球菌（Staphylococcusaureus）、蠟樣枯草芽孢菌（B.cereus）、副血溶弧菌（Vibrioparahemolyticus）等為指示菌，系統(tǒng)軟件挑選具備廣譜性殺菌作用的產(chǎn)病菌素的病菌。在其中分離出來出具備廣譜性抗菌活力的14株病菌經(jīng)16srDNA遺傳基因評(píng)定為枯草芽孢菌。這種枯草芽孢菌生產(chǎn)的病菌素主要是由核糖體生成，并具備耐熱性和酶敏感度等特性。融合Ｔricine-SDS-PAGE電泳原理實(shí)驗(yàn)效果及LC-MS/MS評(píng)定，潛在性病菌素的分子結(jié)構(gòu)質(zhì)量范圍及相應(yīng)的氨基酸序列均表明以上廣譜性病菌素很有可能未被發(fā)現(xiàn)。本研究發(fā)現(xiàn)的新式廣譜性病菌素期待為病菌素的綜合利用以及在食品質(zhì)量安全方面的使用給予數(shù)據(jù)資料。

1 原材料與方式

1.1 試品

杜蠣產(chǎn)于福建霞浦水域，試品置放于-18℃運(yùn)到試驗(yàn)室預(yù)留。

1.2.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)備

超低溫恒溫培養(yǎng)箱（MIR-153），日本三洋（SANYO）電動(dòng)機(jī)企業(yè)；立柱式工作壓力滅菌設(shè)備（YXQ-LS-50SII），上海博迅實(shí)業(yè)公司有限責(zé)任公司診療機(jī)械廠；水準(zhǔn)電泳槽及顯像系統(tǒng)軟件，英國Bio-rad公司；凈化工作臺(tái)（SEX-ＴＪ），上海市整新電子產(chǎn)品；天平秤YP200N，上海市菁海儀器設(shè)備有限責(zé)任公司；PCR儀（2720ＴhermalCycler），英國Ｔhermo企業(yè)；試品解決儀（MPFastprep-24），英國MP企業(yè)。

1.2.2 關(guān)鍵實(shí)驗(yàn)試劑

瓊脂粉，上海市藍(lán)季生物技術(shù)有限責(zé)任公司；凡士林、瓊脂糖，均購于國藥集團(tuán)；基因DNA獲取檢測(cè)試劑盒、DNAMaker、4sGreen無毒性核酸染料、PCR引物設(shè)計(jì)，上海市生工生物技術(shù)性有限責(zé)任公司；Ｔaq酶、ddH2O，上海市拜力生物技術(shù)有限責(zé)任公司；腦心土壤溶液（BrainHeartInfusion，BHI）培養(yǎng)液、乳酸菌飲料培養(yǎng)液（MRS），美國OXIOD企業(yè)。

1.2.3 標(biāo)示菌種

此次測(cè)試的標(biāo)示菌種均由中國水產(chǎn)科學(xué)院南海水產(chǎn)品研究室儲(chǔ)存，需要的指示菌及塑造標(biāo)準(zhǔn)等見表1。

1.3 實(shí)驗(yàn)方式

1.3.1 試品解決

無菌檢測(cè)情況下，稱量10g牡蠣肉剪下來碾磨，加上到配有90mL鹽水的試樣解決袋里，將試品在CPU中勻質(zhì)攪拌2min，用鹽水梯度方向稀釋液至10^-4預(yù)留。

1.3.2 菌種分離出來與塑造

選用稀釋液涂布平板法對(duì)病菌開展單菌體分離出來。各自從10^-3、10^-42個(gè)稀釋液度的封閉液中汲取100μL試品液于BHI培養(yǎng)液上，勻稱施膠后放置30℃標(biāo)準(zhǔn)下留宿塑造。長出菌體后，無菌檢測(cè)情況下選擇單菌體，注射于5mLBHI液體培養(yǎng)基中，放置30℃標(biāo)準(zhǔn)下留宿塑造。

1.3.3 產(chǎn)病菌素菌種的挑選

1.3.3.1 初篩

選用瓊脂粉點(diǎn)種法開展病菌素初篩實(shí)驗(yàn)。將100μL留宿塑造的指示菌加上到5mLBHI培養(yǎng)液（含0.8%的瓊脂粉）中，倒進(jìn)BHI培養(yǎng)液（含2.5%的瓊脂粉）上，勻稱鋪平。待其降溫凝結(jié)而且干躁后，汲取2μL指標(biāo)值菌開展點(diǎn)樣，放置30℃標(biāo)準(zhǔn)下留宿塑造。塑造完成后，在培養(yǎng)液上發(fā)生光亮抑菌圈的則覺得有抗菌活力，能抑止相對(duì)應(yīng)的指示菌。對(duì)有抗菌活力的菌種在摩爾分?jǐn)?shù)13%的凡士林中儲(chǔ)存，放置-20℃儲(chǔ)存預(yù)留。

1.3.3.2 病菌素對(duì)熱和酶的穩(wěn)定性測(cè)試

1）病菌素的耐熱性實(shí)驗(yàn)：將留宿塑造的指標(biāo)值菌液在10000r/min標(biāo)準(zhǔn)下離心式5min。將上清液在開水中置放15min，隨后冰面制冷5min。汲取3μL加溫后的上清液，開展瓊脂粉點(diǎn)種法開展抗菌，沒經(jīng)熱處理工藝的上清液做為對(duì)比。

2）病菌素對(duì)酶的穩(wěn)定性測(cè)試：將指標(biāo)值菌留宿塑造，汲取2μL菌液，選用瓊脂粉點(diǎn)種法開展抗菌實(shí)驗(yàn)；在點(diǎn)過指標(biāo)值菌部位的邊沿，點(diǎn)上1μL濃度值為20μg/mL的胰蛋白酶K，30℃標(biāo)準(zhǔn)下留宿塑造。沒經(jīng)胰蛋白酶K解決的菌液做為對(duì)比。

1.3.4 產(chǎn)病菌素菌種的歸類評(píng)定

1.3.4.1 形狀特點(diǎn)

參考參考文獻(xiàn)開展菌種形狀特點(diǎn)評(píng)定。將菌種注射于BHI平板電腦，37℃留宿塑造，觀查每個(gè)平板電腦菌體形狀，選用革蘭氏染色法觀查病菌形狀。

1.3.4.2 菌種基因DNA獲取，PCR擴(kuò)增和菌種評(píng)定

對(duì)具備抗菌實(shí)際效果的指標(biāo)值菌，按生工Ezup立柱式病菌基因DNA抽提檢測(cè)試劑盒（上海生工）給予的操作方法獲取其DNA。以指示菌基因DNA做為PCR擴(kuò)增的模版，選用通用引物15F和12R（表2）開展PCR擴(kuò)增。PCR反映管理體系（50μL）：ＴaqPCRMasterMix（2x，bluedye）（上海生工）25μL，上游引物（10μmol/L）2μL，中下游引物設(shè)計(jì)（10μmol/L）2μL，基因DNA模版2μL，雙蒸水19μL。增加反映情況為：94℃預(yù)轉(zhuǎn)性4min；進(jìn)到PCR循環(huán)系統(tǒng)環(huán)節(jié)后，94℃轉(zhuǎn)性30s，55℃淬火30s，72℃拓寬30s，共30個(gè)循環(huán)系統(tǒng)；72℃拓寬10min，4℃儲(chǔ)存。PCR物質(zhì)經(jīng)1.5%的瓊脂糖電泳電泳原理后在UＶ燈下觀查到增加雜帶后將未純化的PCR物質(zhì)送至生工生物工程項(xiàng)目（上海市）股權(quán)有限責(zé)任公司開展菌種鑒定。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果得到的基因序列根據(jù)在NCBI的Blast檢索系統(tǒng)數(shù)據(jù)庫查詢中開展BLASＴ序列比對(duì)。