1.3.5 反復(fù)精彩片段基因指紋剖析

以病菌基因DNA為模版，參照Silva等的方式 ，運(yùn)用設(shè)計(jì)方案的BOX引物設(shè)計(jì)（引物設(shè)計(jì)編碼序列見表2）開展rep-PCR擴(kuò)增。待增加進(jìn)行后，將PCR物質(zhì)開展1.5%的瓊脂糖電泳電泳原理并在UＶ燈下觀查電泳原理結(jié)果。

1.3.6 系統(tǒng)發(fā)育樹

將校準(zhǔn)并拼湊后的編碼序列在GenBank中開展同宗編碼序列的檢索，由rep-PCR獲得的大概雜帶狀況，從差別可能考慮，選用層級UPGMA法（UnweightedPair-GroupMeanAverage），依據(jù)供試菌種的rep-PCR擴(kuò)增雜帶的尺寸，選用二進(jìn)制方式，轉(zhuǎn)化成系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.7 質(zhì)粒提取

將產(chǎn)病菌素枯草芽孢菌菌種留宿塑造，運(yùn)用質(zhì)粒提取檢測試劑盒（OMEGAbio-tek，上海市），依據(jù)檢測試劑盒上的講解對留宿塑造的產(chǎn)病菌素枯草芽孢菌菌種開展質(zhì)粒提取。將獲取好的質(zhì)粒DNA在1.5%的瓊脂糖電泳下開展電泳原理并在UＶ燈下觀查電泳原理結(jié)果。

1.3.8 病菌素粗提

1.3.8.1 硫酸銨蛋白質(zhì)變性離子交換法

按1%接種量將留宿塑造好的產(chǎn)病菌素枯草芽孢菌注射到250mL的BHI液體培養(yǎng)基中，放置30℃塑造最少12h。將以上留宿塑造好的菌液于4℃，10000r/min離心式標(biāo)準(zhǔn)下離心式25min，在上清液中加上45%的飽和狀態(tài)硫酸銨拌和融解，放置4℃留宿。將留宿的水溶液在10000r/min標(biāo)準(zhǔn)下離心式30min，將沉積融解于5mL聚磷酸鹽緩沖溶液PBS（pH6.86）中，即獲得病菌素粗提物。

1.3.8.2 疑膠過慮層析

以SephadexG-25為疑膠填充料，超純水系統(tǒng)開展預(yù)過柱后再用PBS過柱柱頭，病菌素粗提物5mL上樣，流動(dòng)速度0.5mL/min，先應(yīng)用PBS開展過柱，以后用0.2，0.5mol/L的氧化鈉（NaCl）先后開展過柱，搜集過柱液。各自對采集的過柱液開展抗菌實(shí)驗(yàn)（汲取2μL粗提物抑止蠟樣枯草芽孢菌），將有抗菌實(shí)際效果的過柱液開展干凍濃縮后復(fù)溶解pH6.86的PBS中放置-20℃預(yù)留。

1.3.9 三羥甲基甘氨酸-SDS-PAGE電泳原理（Ｔricine-SDS-PAGE）

參照Schagger等的方式 ，將干凍濃縮好的病菌素粗純化化學(xué)物質(zhì)在ＴricineSDS-PAGE開展電泳原理。在其中膠質(zhì)量濃度各自為隔層膠10%，濃縮膠4%，分離出來膠16.5%。選用分子質(zhì)量3.3～20.1ku的肽Marker（Solarbio）做為規(guī)范對比。電泳原理完畢后應(yīng)用考馬斯亮藍(lán)G250開展上色褪色，將電泳原理膠在Bio-rad顯像系統(tǒng)軟件下紀(jì)錄結(jié)果。

1.3.10 液相色譜儀-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用

將產(chǎn)病菌素枯草芽孢菌菌株在30℃標(biāo)準(zhǔn)下留宿塑造，將塑造好的菌液在10000r/min標(biāo)準(zhǔn)下離心式30min，取上清液加溫15min解決后，參照Sun等的方式 ，將上清液根據(jù)液相色譜儀-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用剖析蛋白質(zhì)分子品質(zhì)。運(yùn)用目前蛋白組學(xué)資料庫（Omicsbean）對得到的蛋白開展數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與探討

2.1 產(chǎn)病菌素菌種的挑選及評定

從杜蠣中基本挑選出的對普遍食源性病原菌有抗菌活力的菌種有14株（取名為O、S、18、19、26、27、4、6、4-1、F1、F2、F4、Y1、Y2）。這種病菌在板材上具備典型性的枯草芽孢菌形狀，即菌體平扁、不光滑不全透明、邊沿不齊整、微淡黃色，且革蘭氏染色后結(jié)果均呈陽性。這14株菌對普遍病原菌的抗菌譜見表3。在其中O、18、19、26、27、4-1、F1、F2、F4、Y1、Y2等菌種具備廣譜性抗菌性，不但對橙黃色鏈球菌（S.aureus）、蠟樣枯草芽孢菌（Bacilluscereus）、乳酸菌（L.plantanrum）等革蘭氏陽性菌具備不錯(cuò)的抗菌實(shí)際效果，并且對弗氏檸檬酸鈉鏈球菌（C.freundii）、副血溶弧菌（V.parahemolyticus）、大腸埃希菌（E.coli）、腸胃沙門菌（S.enterica）、福氏志賀氏菌（Shigellaflexneri）等革蘭氏陽性菌陰性菌也有著不錯(cuò)的抑制效果。此外，由表3還能夠看得出，菌種18、19、26、27具備類似的抗菌譜，菌種F1、F2、F4、Y1、Y2等抗菌工作能力也十分相似。

將具備抗菌活力的病菌送檢驗(yàn)序，其轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果歷經(jīng)在NCBI上開展Blast序列比對，發(fā)覺這14株指標(biāo)值菌種與枯草芽孢菌屬開放閱讀框最大，均達(dá)到99%之上，可分析判斷其均歸屬于枯草芽孢菌屬。在其中，O為解木薯淀粉枯草芽孢菌（B.amyloliquefaciens），18、19、26、27及其F1、F2、F4、Y1和Y2等菌種均為枯草枯草芽孢菌（B.subtilis），4、6、S各自為簡短枯草芽孢菌（B.pumilus）、廈門市枯草芽孢菌（B.xiamenensis）、蠟樣枯草芽孢菌（B.cereus），4-1為死谷枯草芽孢菌（B.vallismortis）。

2.2 病菌素對熱和酶的穩(wěn)定性測試

病菌生長發(fā)育歷程中形成的抗菌化學(xué)物質(zhì)除開病菌素外，還能夠新陳代謝造成有機(jī)物、抗菌素和H2O2等其他具備抗菌活力的化學(xué)物質(zhì)。為了更好地清除其他影響要素，根據(jù)加溫解決和酶處理方法明確抗菌化學(xué)物質(zhì)為病菌素。挑選出的14株菌在升溫后維持不錯(cuò)的抗菌活力。除此之外，歷經(jīng)胰蛋白酶K解決的平板電腦點(diǎn)菌處抑菌圈不詳細(xì)，這一結(jié)果表明抗菌活性物質(zhì)是耐熱性強(qiáng)的病菌素。

2.3 反復(fù)精彩片段基因指紋剖析（rep-PCR）和系統(tǒng)發(fā)育樹搭建

為了更好地明確同一屬種的病菌基因型是不是一致，本實(shí)驗(yàn)根據(jù)使用獨(dú)特制定的引物設(shè)計(jì)即BOX引物設(shè)計(jì)對抗菌譜類似且評定結(jié)果類似的菌種的DNA開展rep-PCR擴(kuò)增，明確其對應(yīng)的基因圖譜，便于進(jìn)一步對病菌開展區(qū)別。Rep-PCR擴(kuò)增物質(zhì)經(jīng)瓊脂糖電泳電泳原理后的結(jié)果如圖所示1。數(shù)據(jù)顯示，18、26、27的增加物質(zhì)基因圖譜基本一致，即反復(fù)精彩片段基本一致，能夠判斷為一種菌；F1、F2、F4、Y1、Y2等菌種的基因圖譜也展現(xiàn)出一致性，可分辨為同一種菌；4-1與F1、F2、F4、Y1、Y2的rep-PCR擴(kuò)增物質(zhì)在＜1.0kb類似，但在＞1.0kb處雜帶略有不同，分析判斷是同為但不一樣種的菌；O、S、4、6、4-1的雜帶不盡相同，能夠判定為同一屬種的不一樣菌。

依據(jù)rep-PCR擴(kuò)增雜帶結(jié)果，選用二進(jìn)制方式，運(yùn)用UPGMA手機(jī)軟件搭建獲得對應(yīng)的系統(tǒng)發(fā)育樹（如圖2）。數(shù)據(jù)顯示菌種Y1、F4、Y2、F2、F1的開放閱讀框較高，此外，菌種18、26、27位于一個(gè)支系簇，該結(jié)論與rep-PCR結(jié)果一致。由于rep-PCR基因指紋圖譜和系統(tǒng)發(fā)育樹的結(jié)果，融合枯草芽孢菌抗菌譜范疇，能夠分析判斷O、19、F和4-1與其他病菌不一樣，因而事后將采用這4株產(chǎn)病菌素枯草芽孢菌用以進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。

2.4 質(zhì)粒提取

病菌素是根據(jù)核糖體生成發(fā)生的抗菌化學(xué)物質(zhì)。一般狀況下病菌素根據(jù)在性染色體上編號造成，還可以根據(jù)質(zhì)粒造成，也是有一些病菌素的生成是受性染色體和質(zhì)粒的雙向管控造成。為了更好地明確以上病菌素造成的部位，本實(shí)驗(yàn)根據(jù)獲取質(zhì)粒中DNA，分析判斷編號病菌素的遺傳基因是不是坐落于質(zhì)粒，便于于進(jìn)一步對編號病菌素的基因序列或是結(jié)構(gòu)特征給予根據(jù)。結(jié)果發(fā)覺，這4株病菌未發(fā)覺質(zhì)粒。這一結(jié)果表明這種枯草芽孢菌主要是根據(jù)性染色體上的編號遺傳基因造成病菌素。