麥子皮膚過(guò)敏、乳糜瀉、非乳糜瀉麥子比較敏感(NCGS)等“麥子有關(guān)病癥”在世界各國(guó)的患病率在持續(xù)升高。針對(duì)這種病癥病人來(lái)講。防止攝取麥子致敏物蛋白質(zhì)是唯一且合理的方式圈。除研究皮膚過(guò)敏體制、找尋醫(yī)治的切入點(diǎn)外，產(chǎn)品研發(fā)低致敏性的麥子食材變成當(dāng)下急需解決的難題。乳酸菌飲料在進(jìn)行發(fā)酵全過(guò)程中根據(jù)自己的蛋白質(zhì)水解系統(tǒng)軟件溶解有關(guān)蛋白及活性多肽，并根據(jù)產(chǎn)酸更改發(fā)酵面團(tuán)的pH值以激話小麥面粉的內(nèi)源胰蛋白酶.進(jìn)一步加強(qiáng)蛋白的溶解。在蛋白溶解為活性多肽及碳水化合物時(shí)，既更改了面糊口味，也更改了致敏蛋白質(zhì)的成分。除此之外，乳酸菌飲料新陳代謝造成的抗真菌藥化學(xué)物質(zhì)能夠增加商品貨架期，造成的胞外含糖量能夠改進(jìn)面包的質(zhì)量。鑒于此，乳酸菌發(fā)酵做為一種很有發(fā)展前景的發(fā)醇方法，非常值得進(jìn)一步的研究。乳酸菌飲料類(lèi)型多種多樣，現(xiàn)階段針對(duì)其減少麥子蛋白質(zhì)抗原性的分析多聚集于乳酸菌發(fā)醇層面。干酪乳桿菌被證明具備體細(xì)胞被膜胰蛋白酶，而這些酶在溶解蛋白的環(huán)節(jié)中起著很重要的功效。除此之外，很多研究表明生產(chǎn)加工方法危害食材蛋白質(zhì)的抗原性，現(xiàn)階段用以減少食材蛋白質(zhì)抗原性的生產(chǎn)辦法具體有熱處理(蒸制、烤制等)和非熱處理(發(fā)醇、酶解、超聲波等)。蒸制等熱處理方法會(huì)變化食材蛋白質(zhì)的構(gòu)像構(gòu)造，進(jìn)而更改抗原體的構(gòu)像表位。而抗原體蛋白質(zhì)線性表位的影響關(guān)鍵產(chǎn)生在發(fā)醇和酶解全過(guò)程中。Rao等研究發(fā)現(xiàn)超低溫烤制和清煮可以造成較低致敏性的花生仁。Rui等運(yùn)用乳酸菌發(fā)醇減少了黃豆分離蛋白的抗原性。運(yùn)用堿性蛋白酶和蛋白酶k持續(xù)酶解減少了麥子中致敏谷蛋白成分。本科學(xué)研究運(yùn)用分離出來(lái)自發(fā)面中的1株干酪乳桿菌發(fā)酵面團(tuán)，科學(xué)研究其對(duì)麥子致敏物蛋白質(zhì)成分及抗原性的危害，科學(xué)研究生產(chǎn)加工標(biāo)準(zhǔn)與抗原性中間的關(guān)聯(lián)，為開(kāi)發(fā)設(shè)計(jì)低致敏性麥子產(chǎn)品給予理論來(lái)源。

1 原材料與方式

1.1 原材料與實(shí)驗(yàn)試劑

革蘭氏染色檢測(cè)試劑盒、病菌組DNA獲取檢測(cè)試劑盒、乳桿菌可選擇性瓊脂粉、Bradfbrd蛋白質(zhì)濃度值測(cè)定試劑盒、SDS-PAGE分離出來(lái)/濃縮膠緩沖溶液、預(yù)染蛋白質(zhì)Maker、SDS-PAGE蛋白質(zhì)上樣緩沖溶液、AP-羊抗兔二抗、BCIP/NBT偏堿磷酸酯酶著色檢測(cè)試劑盒。北京索萊寶高新科技有限責(zé)任公司：EL-TMB著色檢測(cè)試劑盒，上海市生工生物：實(shí)驗(yàn)常用實(shí)驗(yàn)試劑均為分析純級(jí)，兔皮膚過(guò)敏血清蛋白由試驗(yàn)室自做。

1.2 關(guān)鍵儀器設(shè)備

PCR熱力循環(huán)儀，杭州市晶格常數(shù)儀器設(shè)備有限責(zé)任公司；凝膠成像系統(tǒng)軟件，上海市勤翔儀器設(shè)備有限責(zé)任公司；Mul-tiskanFC酶標(biāo)儀，上海市賽默飛世爾企業(yè)；mini-proteanⅡ疑膠儀，英國(guó)伯樂(lè)相馬企業(yè)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方式

1.3.1 干酪乳桿菌的分離出來(lái)評(píng)定

稱量酸面糊試品5g于無(wú)菌檢測(cè)勻質(zhì)袋里，添加45mL殺菌后的蛋白胨水(1％蛋白胨，0.43％NaCl，0.72％Na₂HP0₄，0.36％KH₂PH0₄，pH7.0)，攪拌后梯度方向稀釋液，取10^-5～10^-7稀釋液梯度方向，施膠于乳桿菌可選擇性瓊脂粉培養(yǎng)液，37℃塑造24h。任意挑菌菌體開(kāi)展過(guò)氧化氫酶和革蘭氏染色實(shí)驗(yàn)。取雙氧水酶呈陰性、革蘭氏陽(yáng)性且鏡檢查為桿狀的菌種開(kāi)展進(jìn)一步分子結(jié)構(gòu)評(píng)定。

選用病菌組DNA獲取檢測(cè)試劑盒獲取所分離出來(lái)菌種的DNA，運(yùn)用病菌通用引物27F(5’-AGCG-GATCACTTCACACAGGACTACGGCTACCTrGTACGA-3’)和1492R(5’-GCAGAGTTCTCGGAGT.CACGAAGAGTlTI’GATCCTGGCTCAG-3’)根據(jù)PCR反映對(duì)16SrRNA遺傳基因開(kāi)展增加。PCR反映情況為：94℃預(yù)轉(zhuǎn)性5min：94℃轉(zhuǎn)性30s。55℃淬火30s，72℃拓寬5min，35個(gè)循環(huán)系統(tǒng)：72℃充足拓寬10min。增加物質(zhì)經(jīng)瓊脂糖電泳電泳原理檢驗(yàn)后送于北京市生工生物工程項(xiàng)目有限責(zé)任公司轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。所得的編碼序列與NCBI百度文庫(kù)核對(duì)后，用MegaX搭建進(jìn)化樹(shù)。

1.3.2 菌種生長(zhǎng)曲線和菌體數(shù)與0D值對(duì)應(yīng)關(guān)系的測(cè)量

取一支凍存菌苗于MRS液體培養(yǎng)基中，37℃下活性24h。取O.5mL活性菌液于6個(gè)各自配有30mLMRS骨頭湯的三角瓶中。37℃塑造0，4，8，12，16，20h，在光波長(zhǎng)600nm處精確測(cè)量各時(shí)間段菌液OD值值，制作生長(zhǎng)曲線。

取活性菌液用MRS骨頭湯稀釋液2，2.5，3，4，5，6倍，測(cè)量0D600nm值，并梯度方向稀釋液，竭盡于MRS瓊脂粉中，37℃塑造48h后測(cè)算活菌數(shù)。

1.3.3 酸面糊的制取

取指數(shù)值成長(zhǎng)期菌液，6000×g離心式10min，鹽水清洗2次，雙蒸水重飄浮至50mL，調(diào)整OD‰數(shù)值0.8。100g小麥面粉與50mL菌懸浮液資金投入壓面機(jī)。揉面15min，面糊內(nèi)菌體總數(shù)約為108CFU/g。發(fā)酵溫度30℃，空氣濕度80％。發(fā)醇24h，按時(shí)抽樣。

1.3.4 發(fā)醇全過(guò)程中pH值、可滴定管酸值(TTA)和面團(tuán)蛋白質(zhì)成分的測(cè)

每過(guò)2h抽樣，于無(wú)菌檢測(cè)勻質(zhì)袋里10倍稀釋液后混和勻稱，測(cè)量pH值并且用0.1mol/LNa0H滴定管至pH數(shù)值8.3，紀(jì)錄所耗費(fèi)Na0H的容積數(shù)即，TTA值。

將發(fā)酵面團(tuán)試品干凍后研磨成粉于-20℃儲(chǔ)存。蛋白質(zhì)獲取參考Prado等的方式 。具體步驟如下所示：向500mg小麥面粉中添加10mL％s-HCl緩沖溶液(50mm01，L，pH8.8)，于4℃下拌和1h，20000×g，4℃離心式20min，搜集上清液(清蛋白和血蛋白)；沉積用5mL緩沖溶液清洗3次，添加10mL75％酒精，室內(nèi)溫度下拌和1h，離心式20min，搜集上清液(醇溶蛋白質(zhì))；選用5mL75％酒精洗滌沉淀3次，添加10mL50mmol/LTris-HCl(pH8.8，1％SDS，0.5％DTT)，4℃拌和2h，離心式20min，搜集上清液(谷蛋白)。選用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)蛋白濃度值。

1.3.5 SDS-PAGE電泳原理及免疫印跡剖析

參考Rao等的方式 ，具體步驟如下所示：制取12％的分離出來(lái)膠和5％的濃縮膠，試品溶液稀釋為同樣濃度值后與5x上樣緩沖溶液混和并開(kāi)水加溫5min，氣相后開(kāi)展豎直電泳原理(濃縮膠工作電壓80V，分離出來(lái)膠工作電壓110V)，電泳原理完畢后選用考馬斯亮藍(lán)R250上色，褪色后于凝膠成像系統(tǒng)軟件照相。

未上色的電泳原理膠遷移至硝酸纖維素膜上(300mA冰浴下轉(zhuǎn)膜90min)，麗春紅上色確定轉(zhuǎn)膜取得成功。添加5％脫脂奶，搖床邊搖晃封閉式2h；添加稀釋液的-抗(抗麥子蛋白質(zhì)兔血清蛋白)，4℃下孵育留宿；TBST緩沖溶液(0.02mol/LTBS，0.05％Tween-20，pH7.6)洗膜后，添加稀釋液的AP-羊抗兔二抗，室內(nèi)溫度下孵育90min；洗膜后。運(yùn)用BCIP/NBT偏堿磷酸酯酶著色檢測(cè)試劑盒著色。

1.3.6 不一樣發(fā)醇方法及熱處理方式制作饅頭

向100g小麥面粉(乳酸菌飲料菌體數(shù)108～109CFU/g)中添加50mL菌懸浮液和0.35g安琪酵母調(diào)配面糊后各自發(fā)醇。冷藏發(fā)酵標(biāo)準(zhǔn)為：4℃發(fā)醇3d后于37℃，80％空氣濕度發(fā)醇60min：一次發(fā)醇標(biāo)準(zhǔn)為：37℃，80％空氣濕度發(fā)醇60min；二次發(fā)酵標(biāo)準(zhǔn)為：中種面糊(60g小麥面粉，0.35g酵母菌，30mL菌懸浮液)于37℃發(fā)醇4h后添加40g小麥面粉和20mL水再次發(fā)醇1h。發(fā)醇好的3種面糊用以烘烤(180℃，20min)和煮制(開(kāi)水煮制20min)。抽樣干凍，研磨成粉預(yù)留。

1.3.7 蛋白質(zhì)成分及酶聯(lián)免疫吸咐實(shí)驗(yàn)測(cè)

總蛋白獲取參考Akagawa等的方式 ，具體步驟如下所示：25mg小麥面粉添加1mL蛋白質(zhì)萃取液[40mmol/LTris，8mol/L尿素溶液，4％3-[3-(膽氟苯丙基)二甲羥基]丙磺酸內(nèi)鹽(cHAPs)，冰浴下超聲波獲取30s，6次；4℃下16000×g離心式20min，搜集上清液，考馬斯亮藍(lán)法測(cè)蛋白量濃度。

選用酶聯(lián)免疫吸咐實(shí)驗(yàn)點(diǎn)評(píng)試品抗原性。應(yīng)用50mmol/L，pH9.6的硫化物緩沖溶液稀釋液蛋白質(zhì)至5μg/mL，按100μL孔添加酶標(biāo)板，4℃靜放留宿；用TBST洗板4次，按150μL/孔添加1％BSA封閉液，37℃溫育2h；TBST洗板后按100μL/孔添加應(yīng)用1％BSA稀釋液的抗麥子蛋白質(zhì)兔血清蛋白封閉液(1:10000)，37℃溫育2h，洗板；按100μL/孔添加500倍稀釋液的羊抗兔HRP-IgG，37℃溫育1h，洗板；應(yīng)用TMB著色檢測(cè)試劑盒著色，于光波長(zhǎng)450nm處測(cè)0D值。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)信息用SPSS手機(jī)軟件解決，圖由GraphPadPrism制作。