1前言

綠色植物細(xì)菌病蟲害是導(dǎo)致農(nóng)業(yè)產(chǎn)品耗損的首要緣由之一，在現(xiàn)實(shí)制造中產(chǎn)生了無(wú)法估量的財(cái)產(chǎn)損失。病菌浸染主莖后，使糧食作物部分或整棵感病，危害植物生長(zhǎng)發(fā)育，比較嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致主莖身亡，造成 農(nóng)業(yè)產(chǎn)品生產(chǎn)量減少，質(zhì)量降低。大部分病菌不但能在植物生長(zhǎng)發(fā)育歷程中危害主莖情況，仍在農(nóng)業(yè)產(chǎn)品的輸送全過(guò)程中導(dǎo)致商品易腐爛，是導(dǎo)致蔬菜水果運(yùn)送耗損的首要緣故。除此之外，一部分細(xì)菌病菌可以代謝真菌毒素，服用帶有真菌毒素的蔬菜水果可以造成 畸胎或引起癌病，威協(xié)人們身心健康。如多種多樣鏈格孢造成的鏈格孢內(nèi)毒素及其多種多樣曲霉造成的伏馬菌素B。

幾丁質(zhì)，是由N-酰胺基-D-葡萄糖胺（N-acetyl-D-glucosamine，GlcNAc）單個(gè)根據(jù)β-1，4-糖苷鍵聯(lián)接的高聚物，也是病源真菌細(xì)胞壁的主要成分。在絲狀真菌中，幾丁質(zhì)和別的聚糖成分占細(xì)胞壁成分的70%之上，在一部分酵母菌中，幾丁質(zhì)成分乃至做到細(xì)胞干重的10%～20%。幾丁質(zhì)酶能夠根據(jù)外切和/或內(nèi)切圓核糖核苷酸功效將幾丁質(zhì)裂化為GlcNAc或GlcNAc的可溶寡聚體。因而，以幾丁質(zhì)做為分子結(jié)構(gòu)靶點(diǎn)，根據(jù)幾丁質(zhì)酶的水解作用來(lái)完成植物病害預(yù)防是植物病害操縱的重要途徑。而害蟲防治因素代謝植物細(xì)胞裂化酶，裂化病源真菌細(xì)胞壁，也變成害蟲防治微生物菌種拮抗作用綠色植物病源細(xì)菌的具體體制之一。

排風(fēng)管菌（Bjerkanderaadusta）歸屬于非褶菌目，多孔結(jié)構(gòu)菌科，排風(fēng)管菌屬。現(xiàn)階段，針對(duì)排風(fēng)管菌（Bjerkanderaadusta）的分析主要是聚集在環(huán)境生態(tài)工程行業(yè)，但仍不缺排風(fēng)管菌對(duì)綠色植物細(xì)菌病蟲害整治的分析報(bào)導(dǎo)。1982年，Dománski發(fā)覺排風(fēng)管菌可以抑止櫟樹（Quercusrobur）褐腐病的產(chǎn)生。2011年，Bak等研究發(fā)現(xiàn)了排風(fēng)管菌對(duì)歐美國(guó)家黑楊（Populuseuramericana）干腐病具備防治工作能力；2015年，汪華等挑選出一株對(duì)水稻紋枯病菌或瓜亡革菌（Thanatephoruscucumeris）、大麗輪枝菌（Verticilliumdahliae）、茄科羅爾氏菌（Ralstoniasolanacearum）等造成的植物病害具備非常好防效的排風(fēng)管菌M-1；2017年，Zhang等研究發(fā)現(xiàn)排風(fēng)管菌可以合理的抑止西瓜蔓枯病原菌（Didymellabryoniae），并在2018年初次研究了排風(fēng)管菌對(duì)核盤菌的抑制效果以及對(duì)油菜菌核病（Sclerotiniasclerotiorum）的防效。但現(xiàn)階段，依然欠缺排風(fēng)管菌害蟲防治體制科學(xué)研究。本科學(xué)研究融合抗病性實(shí)際效果和RT-qPCR剖析，初次從排風(fēng)管菌中挑選并復(fù)制出一個(gè)幾丁質(zhì)酶遺傳基因，并根據(jù)外源性表述證實(shí)了該酶的抗真菌藥活力。推斷該遺傳基因是排風(fēng)管菌充分發(fā)揮生防功效歷程中的植物細(xì)胞裂化酶遺傳基因。

2原材料與方式

2.1原材料

本氏煙（Nicotianabenthamiana）。

排風(fēng)管菌（Bjerkanderaadusta）菌種BK-1從四川省馬爾康市土壤層中得到，儲(chǔ)藏于本試驗(yàn)室，ITS系列號(hào)為MW182414（NCBI）。鏈格孢（Alternariaalternata）菌種CD-1，鏈格孢iPhone?；停ˋlternariaalternataf.sp.mali）L-1，細(xì)極鏈格孢（Alternariatenuissima）SCAU-1和灰紅提孢（Botrytiscinerea）DY-1均為本試驗(yàn)室儲(chǔ)藏菌苗。尖孢鐮刀菌（Fusariumoxysporum）（BNCCNO.143078），茄鏈格孢（Alternariasolani）（BNCCNO.337910）購(gòu)自北納生物（BeNaCultureCollection，BNCC）。

PCR引物設(shè)計(jì)見表1及表2。

2.2方式

2.2.1排風(fēng)管菌抗病性工作能力剖析

將灰紅提孢，鏈格孢和細(xì)極鏈格孢接轉(zhuǎn)到PDA培養(yǎng)液中25℃活性塑造7d，應(yīng)用外徑為5mm的打孔器割除真菌瓊脂塊做為接種物；排風(fēng)管菌活性塑造7d后，將五個(gè)直徑為5mm的排風(fēng)管菌真菌瓊脂塊注射至液態(tài)的100mLPDB培養(yǎng)液中25℃，180r/min活性塑造7d后應(yīng)用破碎機(jī)粉碎，做成排風(fēng)管菌真菌懸浮液做為抗菌液（AntiL）預(yù)留。

石蠟切片試驗(yàn)：從生長(zhǎng)發(fā)育30d的香煙主莖上裁取身心健康的香煙葉子水流清洗10min，應(yīng)用保鮮袋封死葉莖創(chuàng)口處，置放于無(wú)菌水淋濕的三層過(guò)濾紙上，在主葉柄兩邊對(duì)稱性部位各自擦抹50μL無(wú)菌水和排風(fēng)管菌真菌懸浮液后注射病菌真菌瓊脂塊做為對(duì)照實(shí)驗(yàn)和對(duì)照組，每一組6反復(fù)。再將葉子和過(guò)濾紙放進(jìn)頂層張口的塑料盒子中，頂層應(yīng)用保鮮袋密封維持盒里潮濕。將其放置溫室大棚內(nèi)（23℃，16h陽(yáng)光照射；18℃，8h黑喑），維持48h（細(xì)極鏈格孢浸染96h）后對(duì)香煙葉子開展拍攝紀(jì)錄。

活體實(shí)驗(yàn)：選擇身心健康的香煙主莖，將從上至下第4片葉子做為注射目標(biāo)，接種方法同離體試驗(yàn)。將注射后的主莖置放在密閉式，透光性且潮濕的育苗盆內(nèi)，溫室大棚塑造48h（細(xì)極鏈格孢浸染96h）后照相紀(jì)錄。

以上試驗(yàn)最少反復(fù)2次，并應(yīng)用ImageJ開展葉子感病總面積統(tǒng)計(jì)分析。

2.2.2生物信息學(xué)剖析

參照該菌種基因有關(guān)信息（NCBIBioProjectID：PRJNA667319），應(yīng)用SignalPv5.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）對(duì)其幾丁質(zhì)酶遺傳基因和β-1，3-甘酶遺傳基因開展信號(hào)肽預(yù)測(cè)分析；并在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)查詢（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）對(duì)幾丁質(zhì)酶的傳統(tǒng)結(jié)構(gòu)域開展核對(duì)。

2.2.3僵持塑造及RT-qPCR剖析

將6種病源細(xì)菌和排風(fēng)管菌注射到PDA培養(yǎng)液中，25℃遮光情況下活性塑造5d，應(yīng)用打孔器取各菌體邊沿處直徑為5mm的菌塊。各自將排風(fēng)管菌和一種病菌注射到新的PDA培養(yǎng)液中，各間距平板電腦邊沿2cm，并使兩菌塊維持在同一直徑網(wǎng)上25℃遮光塑造。

應(yīng)用細(xì)菌RNA迅速抽提檢測(cè)試劑盒（生工），獲取僵持塑造研究中注射后第六d互相觸碰地區(qū)真菌的RNA，應(yīng)用EasyScript©One-StepgDNARemovalandcDNASynthesisSuperMix（全式金）開展反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA.以cDNA為模版，以18SrRNA做為參照遺傳基因，應(yīng)用2×T5FastqPCRMix（SYBRGreenII）檢測(cè)試劑盒（擎科）對(duì)預(yù)測(cè)分析具備信號(hào)肽構(gòu)造的幾丁質(zhì)酶遺傳基因和β-1，3-甘酶遺傳基因開展表述量測(cè)量。

2.2.4排風(fēng)管菌幾丁質(zhì)酶遺傳基因BaCHIB復(fù)制

應(yīng)用高保真音響酶1-5TM2×Hight-FidelityMasterMix（MCLAB）增加除去信號(hào)肽區(qū)間的幾丁質(zhì)酶遺傳基因BaCHIB-T，并在C端加上6×His蛋白純化標(biāo)識(shí)。以排風(fēng)管菌cDNA為原始模版，事后PCR全過(guò)程先后應(yīng)用上一步增加物質(zhì)為模版，獲得目地精彩片段BaCHIB-T，實(shí)際引物設(shè)計(jì)如下所示：①.BaCHIB-Cl-F/R；②.BaCHIB-Cl-F和His1-R；③.BaCHIB-Cl-F和His2-R；④.EcoRⅠ-T-F和NotⅠ-R。

應(yīng)用約束性內(nèi)切酶EcoRⅠ和NotI解決媒介pPIC9K.運(yùn)用同源重組檢測(cè)試劑盒（諾唯贊）將BaCHIB-T與歸一化處理的媒介同源重組獲得資產(chǎn)重組媒介pPIC9K-BaCHIB-T（圖1），轉(zhuǎn)錄組測(cè)序恰當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體應(yīng)用約束性內(nèi)切酶salⅠ歸一化處理，冰醋酸鋰轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)換畢赤酵母（Pichiapastoris）GS115菌種。

2.2.5重組蛋白的體現(xiàn)和提純及抗真菌藥活力

蛋白質(zhì)的體現(xiàn)和提純依照Deng等的辦法開展，并做好改善。資產(chǎn)重組媒介的表述菌種經(jīng)0.5%的工業(yè)甲醇誘發(fā)5d，同樣解決的滿載轉(zhuǎn)換菌種用以對(duì)照實(shí)驗(yàn)。先后應(yīng)用帶有80，100，120，140mmol/L咪唑的聚磷酸鹽緩沖溶液（PBS）過(guò)柱與柱融合的總體目標(biāo)蛋白質(zhì)。目地雜帶經(jīng)SDS-PAGE電泳原理檢驗(yàn)。幾丁質(zhì)酶活力測(cè)量應(yīng)用幾丁質(zhì)酶活力診斷試劑盒（索萊寶）。

提純后的重組蛋白，濃度值調(diào)節(jié)為200μg/mL開展抗真菌藥活力檢驗(yàn)。從活性5d的鏈格孢，茄鏈格孢和灰紅提孢的平板電腦邊沿割除二塊周長(zhǎng)約為5～10mm的方形真菌瓊脂塊，并將其放置2mL離心管架中。每管添加400μL提純蛋白質(zhì)水溶液做為對(duì)照組，相等蛋白質(zhì)過(guò)柱液做為對(duì)照實(shí)驗(yàn)25℃暗塑造48h后，觀查真菌生長(zhǎng)發(fā)育情況。