3結(jié)果與剖析

3.1排風(fēng)管菌的抵抗工作能力剖析

以香煙為宿主，檢測排風(fēng)管菌對由灰紅提孢造成的灰霉病，由鏈格孢造成的赤星病和黑斑病的控制實際效果開展抗病性基因型試驗（表3）。結(jié)果顯示，在石蠟切片和活物標(biāo)準(zhǔn)下，排風(fēng)管菌可以使灰霉病病斑總面積各自降低91.97%和100%；使赤星病病斑總面積降低77.12%和75.03%。而在黑斑病的對照組中，石蠟切片標(biāo)準(zhǔn)下并沒有觀查到顯著的抗病性實際效果；活物注射病菌時，反復(fù)多次未監(jiān)測到顯著病發(fā)征兆。

香煙灰霉病、香煙赤星病和香煙黑斑病各自由灰紅提孢、鏈格孢和細(xì)極鏈格孢造成香煙葉子的病斑總面積精確測量后，被用于較為排風(fēng)管菌對以上三種病蟲害的抵抗工作能力數(shù)據(jù)信息應(yīng)用單要素方差分析，“*”表明差別明顯（P<0.001）。

3.2生物信息學(xué)剖析

對該菌種的基因開展剖析，發(fā)覺排風(fēng)管菌該菌種具備11個幾丁質(zhì)酶遺傳基因，12個β-1，3-甘酶遺傳基因。在其中五個幾丁質(zhì)酶遺傳基因（EVM0010419；EVM0005032；EVM0003995；EVM0003825；EVM0009013）和3個β-1，3-甘酶遺傳基因（EVM0006890；EVM0003791；EVM00010135）所相對應(yīng)的蛋白質(zhì)編碼序列N端具備信號肽構(gòu)造排風(fēng)管菌幾丁質(zhì)酶遺傳基因的傳統(tǒng)結(jié)構(gòu)域分析表明，排風(fēng)管菌幾丁質(zhì)酶遺傳基因均歸屬于GH18基因家族。除此之外，EVM0005032和EVM0003825尾端含有Chic_BD（aromaticchitin/cellulosebindingsiteresidues）構(gòu)造，歸屬于B類幾丁質(zhì)酶（CHIB）。

3.3幾丁質(zhì)酶遺傳基因和β-1，3-甘酶基因表達(dá)譜分析

RT-qPCR剖析僵持塑造第六d的排風(fēng)管菌植物細(xì)胞裂化酶基因表達(dá)水準(zhǔn)結(jié)果顯示在該環(huán)節(jié)，好幾個基因的表達(dá)量上漲，如幾丁質(zhì)酶遺傳基因EVM0005032，EVM0003825和EVM0009013，β-1，3-甘酶遺傳基因EVM0006890（圖2）。尤其是幾丁質(zhì)酶遺傳基因EVM60005032（BaCHIB），在與鏈格孢、茄鏈格孢、灰紅提孢和尖孢鐮刀菌的僵持塑造時，該遺傳基因各自上漲表述27.3倍、31.7倍、50.3倍和41.3倍（圖2B），但在與鏈格孢iPhone?；秃图?xì)極鏈格孢相互影響時，該遺傳基因未產(chǎn)生對應(yīng)的上漲表述。整體上看來，除遺傳基因EVM0005032外，其他遺傳基因上漲的情形主要是聚集在排風(fēng)管菌與茄鏈格孢和尖孢鐮刀菌的僵持塑造中，如遺傳基因EVM0009013和EVM0006890在解決茄鏈格孢時表述上漲（圖2e，2f）。此外，同為B類幾丁質(zhì)酶遺傳基因的EVM0003825僅在與尖孢鐮刀菌的僵持塑造中發(fā)生顯著的上漲表述（圖2d）。

3.4幾丁質(zhì)酶BaCHIB的抗真菌藥活力

應(yīng)用鎳柱對重組蛋白BaCHIB開展了分離純化，在咪唑濃度值為80mmol/L時目地蛋白質(zhì)能被高效率過柱，并在之后的SDS-PAGE中表明為單一雜帶（圖3）。尺寸在50～70kD中間，與預(yù)測分析分子結(jié)構(gòu)大小63.6kD相仿。對凈化后的重組蛋白開展活力測量，在37℃下幾丁質(zhì)酶活力約為17.7U/mg。

對幾丁質(zhì)酶BaCHIB開展抗真菌藥活力檢測，經(jīng)48h溫育，相比于對照實驗，加上BaCHIB的對照組中，鏈格孢、茄鏈格孢和灰紅提孢均無新生兒真菌生長發(fā)育的印痕，主要表現(xiàn)出突出的生長發(fā)育抑制效果。

圖2注射6d后排風(fēng)管菌預(yù)測分析具備信號肽構(gòu)造的植物細(xì)胞裂化酶遺傳基因相對性表述量分析將排風(fēng)管菌獨立塑造做為對照實驗；A1為鏈格孢；A2為鏈格孢iPhone專化型；A3為茄鏈格孢；A4為細(xì)極鏈格孢；B灰紅提孢；F為尖孢鐮刀菌.依據(jù)多重比較結(jié)果，不一樣英文字母表明差別明顯（P≤0.05）。

圖3重組蛋白BaCHIB的提純

4探討

本分析根據(jù)石蠟切片和活體實驗，證實了排風(fēng)管菌對香煙灰霉病和赤星病具備優(yōu)良的抗病性實際效果。但在香煙黑斑病的石蠟切片浸染4d后，排風(fēng)管菌使用是否對病發(fā)總面積并無顯著危害，表明在石蠟切片標(biāo)準(zhǔn)下排風(fēng)管菌對香煙黑斑病沒有抗病性實際效果，而在活體實驗中，對照組和對照實驗均沒病斑的產(chǎn)生，該狀況很有可能因為采用的細(xì)極鏈格孢菌種浸染工作能力較差，造成 浸染后沒什么感覺病基因型發(fā)生。

生防微生物菌種根據(jù)代謝植物細(xì)胞裂化酶抑止病菌的發(fā)育是其充分發(fā)揮生防功效的具體體制之一，如幾丁質(zhì)酶，β-1，3-甘酶，淀粉酶和胰蛋白酶，這種酶體一般在毀壞病原菌的植物細(xì)胞中起著非常重要的功效。為了更好地基本研究排風(fēng)管菌植物細(xì)胞裂化酶在排風(fēng)管菌抗病性中的功效，本分析利用生物信息學(xué)和RT-qPCR的方向考慮，對排風(fēng)管菌一部分植物細(xì)胞裂化酶開展剖析。

GH18大家族普遍出現(xiàn)于原核生物，真核生物甚至病毒感染中。依照結(jié)構(gòu)域差別可分成兩類：ClassIII（B類）和ClassV（A類）。在其中B類幾丁質(zhì)酶帶有幾丁質(zhì)或含糖量融合結(jié)構(gòu)域，這類幾丁質(zhì)酶關(guān)鍵參加細(xì)菌成長發(fā)育歷程中的養(yǎng)分消化吸收，并在纖毛蟲和一部分細(xì)菌內(nèi)寄生蟲類的環(huán)節(jié)中起到主要功效。除此之外，此類幾丁質(zhì)酶基因結(jié)構(gòu)與綠色植物幾丁質(zhì)酶遺傳基因類似，而后面一種一般與寄主植物對病源病菌，細(xì)菌及纖毛蟲的抵抗性有關(guān)。從而可推斷，排風(fēng)管菌幾丁質(zhì)酶遺傳基因EVM0005032（BaCHIB）和EVM0003825很有可能在排風(fēng)管菌對病源細(xì)菌的害蟲防治中起到至關(guān)重要的分子生物學(xué)功效。

圖4資產(chǎn)重組幾丁質(zhì)酶BaCHIB的抗真菌藥活力三角形標(biāo)志標(biāo)示瓊脂塊，箭頭圖標(biāo)標(biāo)示病源細(xì)菌新生兒真菌。

應(yīng)用RT-qPCR對預(yù)測分析具備信號肽構(gòu)造的幾丁質(zhì)酶遺傳基因和β-1，3-甘酶基因表達(dá)譜開展深入分析測量，借此機(jī)會挑選出很有可能具備抗真菌藥活力的植物細(xì)胞裂化酶遺傳基因。在僵持塑造操作過程中，好幾個遺傳基因在注射6d后表述量上漲，尤其是，幾丁質(zhì)酶遺傳基因EVM0005032。結(jié)果顯示一部分綠色植物念珠菌性病源，如鏈格孢，茄鏈格孢，尖孢鐮刀菌和灰紅提孢，可以立即誘發(fā)排風(fēng)管菌植物細(xì)胞裂化酶基因表達(dá)。這一結(jié)論與Banani等的科學(xué)研究類似，桃梅奇酵母菌（Metschnikowiafructicola）菌種AP47在桃褐腐病原菌（Moniliniafructicola）植物細(xì)胞提取液誘發(fā)下，其幾丁質(zhì)酶遺傳基因MfChi上漲表述14倍，并在之后的試驗中體現(xiàn)出水蜜桃褐腐病的明顯抑止工作能力。除此之外，Essghaier等在科學(xué)研究一種嗜鹽菌對草莓灰霉病的預(yù)防全過程中，發(fā)覺枯草枯草芽孢菌可以代謝各種具備抗真菌藥活力的抗氧化物：幾丁質(zhì)酶，β-1，3-甘酶，纖維素酶和胰蛋白酶；Urbina等在其科學(xué)研究中也發(fā)覺橄欖假絲酵母代謝的一種β-1，3-甘酶對iPhone病菌拓展青霉具備拮抗作用工作能力。以上科學(xué)研究為排風(fēng)管菌幾丁質(zhì)酶BaCHIB具備抗真菌藥活力的如果給予了相對的根據(jù)。另一方面，同歸屬于B類幾丁質(zhì)酶的遺傳基因EVM0003825，僅在排風(fēng)管菌與尖孢鐮刀菌的僵持塑造中發(fā)生上漲表述，而未發(fā)生類似BaCHIB在解決多種多樣病源細(xì)菌時的高表述狀況，這一結(jié)果表明，幾丁質(zhì)酶遺傳基因BaCHIB很有可能在解決病源細(xì)菌具備一定的非特異。

融合抗病性實際效果與幾丁質(zhì)酶遺傳基因BaCHIB的誘發(fā)表述剖析，說明排風(fēng)管菌對綠色植物細(xì)菌病蟲害抗病性主要表現(xiàn)與BaCHIB的誘發(fā)表述狀況的發(fā)生高寬比同歩。如排風(fēng)管菌對香煙灰霉病和赤星病具備抗病性工作能力，幾丁質(zhì)酶遺傳基因BaCHIB在與灰紅提孢和鏈格孢的僵持塑造中發(fā)生誘發(fā)表述；對香煙黑斑病沒有明顯的抗病性實際效果，BaCHIB不發(fā)生明顯的誘發(fā)表述。這一結(jié)果為幾丁質(zhì)酶遺傳基因BaCHIB在排風(fēng)管菌的害蟲防治中起到主要功效給予了又一重要直接證據(jù)。

根據(jù)真核外源性表述系統(tǒng)軟件，排風(fēng)管菌幾丁質(zhì)酶BaCHIB可以被取得成功表述和提純。并呈現(xiàn)出幾丁質(zhì)酶活力和較好的抗真菌藥活力。這一結(jié)果證實了幾丁質(zhì)酶BaCHIB具備抗真菌藥工作能力在Ahmed等的分析中，翠綠色木霉幾丁質(zhì)酶在含量為2.23mg/mL時，對尖孢鐮刀菌塑造5d后的抗菌工作能力為45%；而另一種來源于珊瑚礁革蘭陰性桿菌的幾丁質(zhì)酶，在含量為0.15mg/mL和0.75mg/mL時，對稻瘟病菌分生孢子出芽抑制率各自在40%和10%上下；而來自哈茨木霉的幾丁質(zhì)酶Chit46，在含量為3.9μg/mL時，對灰紅提孢塑造5d后的成長抑止工作能力為76%，主要表現(xiàn)出較以上二種幾丁質(zhì)酶更加高效率的抗菌工作能力在本分析中，三種病源細(xì)菌在0.2mg/mL的幾丁質(zhì)酶水溶液中塑造2d后，新生兒真菌生長發(fā)育被明顯抑止，證實排風(fēng)管菌幾丁質(zhì)酶BaCHIB一樣具備不錯的抗真菌藥工作能力。

本試驗結(jié)果顯示，具備生防工作能力的排風(fēng)管菌BK-1可能是根據(jù)代謝幾丁質(zhì)酶BaCHIB完成其對一些綠色植物細(xì)菌病蟲害的抑止，但主要的害蟲防治體制，依然必須在這個基礎(chǔ)上實現(xiàn)更為深層次的科學(xué)研究。