伴隨著大家對(duì)氧自由基性命科學(xué)研究的持續(xù)關(guān)心，氧化應(yīng)激損害和抗氧化性維護(hù)功能的分析變成網(wǎng)絡(luò)熱點(diǎn)。因身體中抗氧化性的化學(xué)物質(zhì)比較有限當(dāng)還原劑與人體內(nèi)抗氧劑不平衡時(shí)，人感受處在氧化應(yīng)激情況。當(dāng)身體的還原劑濃度值超出體細(xì)胞防御力時(shí)，空氣氧化損害可造成如癌病，多發(fā)性硬化癥癥和心腦血管疾病等病癥?，F(xiàn)階段最多見的是有機(jī)化學(xué)抗氧劑，但因其有一定的副作用因此應(yīng)用受限制。近些年研究發(fā)現(xiàn)，由胰蛋白酶水解反應(yīng)制取的生物活性肽具備一定的抗氧化能力，水解反應(yīng)出的抗氧化性肽與生物大分子蛋白對(duì)比，顯具備更好的生物活性，抗氧化性肽在身體內(nèi)累積具備降低膽固醇和抑止脂質(zhì)過氧化的作用，可以保持人體內(nèi)氧自由基的均衡，進(jìn)而增強(qiáng)人體延緩衰老和抗病癥的工作能力。抗氧化性肽以其具備安全性、高效率、易消化吸收等特性，在健康保健、診療等行業(yè)得到了管飯的高度重視。

黑豆別名青豆豆，歸屬于醫(yī)食雙用農(nóng)作物，是在我國具體的農(nóng)作物之一，在國內(nèi)多地域栽種，年平均生產(chǎn)量在6l萬噸級(jí)且含有優(yōu)質(zhì)的大豆蛋白，是高質(zhì)量的食品工業(yè)原材料。服用黑豆好處多種多樣，如能夠軟化血管、提升 人體免疫能力、防止變老及其具備抗氧化性等功效。黑豆活性多肽中的抗氧化性小分子活性肽相對(duì)性分子質(zhì)量小，具備優(yōu)良的水溶、低粘度、可靠性強(qiáng)，是自然的抗氧劑，可以具有消除身體氧自由基、抑止分子伴侶化學(xué)物質(zhì)過氧化物的功效，具備防衰老、預(yù)防傳染病等優(yōu)勢，有很高的使用使用價(jià)值。但就現(xiàn)在來講，黑豆抗氧化性活性多肽的配制技術(shù)科學(xué)研究較少，不可以符合目前的要求，產(chǎn)品成本較高，制取加工工藝不太完善，針對(duì)黑豆活性多肽獲取的探究擁有 主要實(shí)際意義。

一、原材料與方式

1、原材料及實(shí)驗(yàn)試劑

黑豆蛋白質(zhì)：試驗(yàn)室自做；硫酸：中國藥業(yè)上海市化學(xué)藥品企業(yè)；堿性蛋白酶(6000U/g)：Sigma試劑公司；氫氧化鈉溶液、DPPH、工業(yè)乙醇：之上均為分析純，均購自天津科密歐實(shí)驗(yàn)試劑有限責(zé)任公司。

2、關(guān)鍵實(shí)驗(yàn)儀器

紫外線由此可見分光光度儀：上海市舜宇恒平儀器設(shè)備有限責(zé)任公司；電加熱恒溫水浴鍋：上海博訊實(shí)業(yè)公司有限責(zé)任公司診療機(jī)械廠；高精密pH計(jì)：梅特勒托利多儀器設(shè)備(上海市)有限責(zé)任公司；干燥烘箱：湘儀離心機(jī)儀器設(shè)備有限責(zé)任公司；電子分析天平(RSJ200—4)：湘儀離心機(jī)儀器設(shè)備有限責(zé)任公司；離心脫水機(jī)(TDZ5一WS)：湘儀離心機(jī)儀器設(shè)備有限責(zé)任公司。

3、實(shí)驗(yàn)方法

（1）黑豆抗氧化性肽的制取

將黑豆蛋白質(zhì)配備成一定含量的水溶液，水浴加熱至100℃開展15min勻質(zhì)解決。待水溶液降溫至酶解適宜溫度，水浴隔熱保溫，向水溶液中添加0.5mol／L的NaOH調(diào)整其pH，酶解一段時(shí)間后100℃水浴消滅10min，室內(nèi)溫度下離心式(4000r／min，20min)，將上清液干凍后儲(chǔ)存。

（2）DPPH氧自由基消除工作能力的測量

參考于慧等的辦法開展DPPH氧自由基清除率的測量。將2mL一定含量的黑豆活性多肽水溶液和2mL的0.12mm01·L^-1DPPH水溶液開展混和，遮光于25℃標(biāo)準(zhǔn)下反映30min，取下后于517nm光波長下開展吸光度值的測量，這時(shí)OD值值紀(jì)錄為A_i；將以上全過程中的2mLDPPH水溶液用沒有水酒精替代，隨后與2mL黑豆活性多肽水溶液開展反映，此前提下測量吸光度值紀(jì)錄為A_j，將2mL工業(yè)乙醇與2mLDPPH水溶液反映的標(biāo)準(zhǔn)做為空缺組，這時(shí)紀(jì)錄吸光度數(shù)值A(chǔ)o。
DPPH清除率計(jì)算方法如下所示：

A_i：試品組OD值值；

A_j：對(duì)照實(shí)驗(yàn)OD值值；

A₀：空缺組OD值值。

（3）單要素試驗(yàn)

本試驗(yàn)取決于科學(xué)研究酶法對(duì)黑豆蛋白質(zhì)水解反應(yīng)的抗氧化性肽的技術(shù)提升，故以DPPH為指標(biāo)值，挑選酶解時(shí)間、酶解溫度、酶加上量及其pH為要素開展單要素試驗(yàn)。

①酶解溫度對(duì)黑豆活性多肽抗氧化的危害

將底物濃度值為4％、pH為9、酶解時(shí)間3h做為固定不動(dòng)標(biāo)準(zhǔn)，測量當(dāng)酶解溫度各自為30℃、40℃、50℃、60℃、70℃五個(gè)標(biāo)準(zhǔn)下時(shí)的DPPH清除率。

②酶濃度值對(duì)黑豆活性多肽抗氧化的危害

將pH為9、酶解溫度50℃、酶解時(shí)間3h做為固定不動(dòng)標(biāo)準(zhǔn)，測量當(dāng)酶濃度值分別為2％、4％、6％、8％、10％五個(gè)標(biāo)準(zhǔn)下時(shí)的DPPH清除率。

③pH對(duì)黑豆活性多肽抗氧化的危害

將底物濃度值為4％、酶解溫度50℃、酶解時(shí)間3h做為固定不動(dòng)標(biāo)準(zhǔn)，測量當(dāng)pH各自為7、8、9、10、11五個(gè)標(biāo)準(zhǔn)下時(shí)的DPPH清除率。

④酶解時(shí)間對(duì)黑豆活性多肽抗氧化的危害

將底物濃度值為4％、pH為9、酶解溫度50℃做為固定不動(dòng)標(biāo)準(zhǔn)，測量當(dāng)酶解時(shí)間各自為0.5h、lh、2h、3h、4h五個(gè)標(biāo)準(zhǔn)下時(shí)的DPPH清除率。

（4）響應(yīng)面可靠性設(shè)計(jì)

根據(jù)單要素試驗(yàn)的結(jié)果，能夠挑選出各要素的三個(gè)水準(zhǔn)。因此在這個(gè)基礎(chǔ)以上，運(yùn)用數(shù)據(jù)分析手機(jī)軟件創(chuàng)建4要素3水準(zhǔn)的Box—Behnken實(shí)體模型，開展回復(fù)面可靠性設(shè)計(jì)。要素和水準(zhǔn)選值如表1所顯示。

二、結(jié)果與探討

1、單要素試驗(yàn)結(jié)果

（1）黑豆活性多肽抗氧化與酶解溫度的關(guān)聯(lián)

將黑豆蛋白質(zhì)配備成一定含量的水溶液，水浴加熱至100℃開展15min勻質(zhì)解決。待水溶液降溫至酶解適宜溫度，水浴隔熱保溫，向水溶液中添加0.5mol／L的NaOH調(diào)整其pH，酶解一段時(shí)間后100℃水浴消滅10min，室內(nèi)溫度下離心式(4000r／min，20min)，將上清液干凍后儲(chǔ)存。結(jié)果如圖所示1所顯示。

由圖1得知，當(dāng)酶解溫度小于50℃，DPPH清除率與氣溫正相關(guān)，當(dāng)氣溫超出50℃時(shí)，DPPH清除率逐漸降低。這是由于胰蛋白酶對(duì)平穩(wěn)的需求較高，溫度過低會(huì)危害酶解的反應(yīng)速率，使酶解反映不完全，進(jìn)而危害抗氧化性肽的抗氧化性實(shí)際效果。而氣溫過高而會(huì)危害蛋白質(zhì)酶的活性，使蛋白質(zhì)酶的活性減少，沒法使蛋白質(zhì)水解反應(yīng)成具備抗氧化的小分子活性肽段，進(jìn)而使DPPH清除率減少。