3、色譜標(biāo)準(zhǔn)

Agilent5HC-C18（2）（4.6×250mm，5μm）離子交換柱，進(jìn)樣量20μL，流動速度1.0mL/min，柱溫35℃，以工業(yè)甲醇做為流動性相A，以0.02moI/L乙酸銨水溶液為流動性相B，梯度方向過柱，過柱標(biāo)準(zhǔn)見表1。應(yīng)用二極管列陣探測器，光譜儀范疇190～700nm；光譜儀步進(jìn)電機(jī)數(shù)值2.0nm，光譜儀收集方式。以保存期及光譜圖判定，在230nm和625nm光波長下開展檢驗(yàn)，峰總面積外標(biāo)法定量分析。

二、結(jié)果與探討

1、色譜儀標(biāo)準(zhǔn)的提升

本實(shí)驗(yàn)較為乙腈-0.02mol/L乙酸銨和工業(yè)甲醇-0.02mol/L乙酸銨按表1梯度方向開展過柱時，發(fā)覺新紅與苯甲醛，靛青與脫氫乙酸分離度達(dá)不上1.5的規(guī)定，緣故將會有幾個方面：最先，乙腈過柱工作能力比工業(yè)甲醇強(qiáng)，在UV光波長較短的色譜上具備較高靈敏，且色譜儀級的乙腈是吸收力較為小的有機(jī)溶液，故乙腈過強(qiáng)的過柱工作能力及其乙腈獨(dú)有的特性都是會導(dǎo)致出峰時間靠前的目的物和殘?jiān)寤蚴青徑姆咫x不開；次之，苯甲醛、山梨酸、脫氫乙酸、納他霉素旋光性相較檸檬黃、日落黃、誘惑紅旋光性稍強(qiáng)，選用乙腈階梯性梯度方向過柱，出峰速度更快，控制不了栽培基質(zhì)基準(zhǔn)線影響；其次，點(diǎn)心中的栽培基質(zhì)大部分為碳酸鹽、蛋白、糖原等，乙腈過柱不可以合理規(guī)避這種栽培基質(zhì)對目的物的影響，實(shí)驗(yàn)中也根據(jù)調(diào)節(jié)梯度方向過柱的占比，可是不管怎樣調(diào)節(jié)依然不能將13種總體目標(biāo)物徹底分離出來，殊不知選用工業(yè)甲醇過柱可以有效的防止乙腈存有的這種難題，結(jié)果見圖1。此次實(shí)驗(yàn)還挑選了工業(yè)甲醇一0.02mol/L乙酸銨與工業(yè)甲醇-0.02mol/L磷酸二氫銨水溶液開展梯度方向過柱，13種食用添加劑均為旋光性化學(xué)物質(zhì)，與水均能相溶，選用0.02mol/L磷酸二氫銨對添加劑的分開沒有危害，可是這一水體的流動性相對性色譜儀分離出來危害很大，絕大多數(shù)色譜儀均不可以合理過柱，結(jié)果見圖2，綜合性考慮到，本實(shí)驗(yàn)最后挑選工業(yè)甲醇一0.02mol/L乙酸銨按表1程序流程開展分離出來。

2、試品前解決提升

（1）蛋白質(zhì)混凝劑的挑選

人造黑色素與添加劑、甜味素的前解決辦法不一樣，參照有關(guān)參考文獻(xiàn)，此次實(shí)驗(yàn)對于點(diǎn)心中的栽培基質(zhì)，挑選水體蛋白質(zhì)混凝劑，即106g/L亞鐵氰化鉀和219g/L乙酸鋅水溶液做好解決，這二種水體蛋白質(zhì)混凝劑均為中性鹽，中性鹽對蛋白的溶解性有明顯危害，亞鐵氰化鉀和乙酸鋅沉積蛋白是一種蛋白質(zhì)變性反映，因?yàn)榈鞍资且环N膠體溶液，乙酸鋅與亞鐵氰化鉀反映產(chǎn)生的氰亞鐵酸鋅沉積可以挾走或吸咐影響化學(xué)物質(zhì)，且這二種中性鹽除蛋白質(zhì)工作能力強(qiáng)，與此同時濃度較高的的鹽正離子凝固工作能力很強(qiáng)，可以將蛋白質(zhì)分子的凝固層奪得，由于各種各樣蛋白質(zhì)分子顆粒物的大小不一樣，故蛋白質(zhì)變性需要的含鹽量也不一樣，此次實(shí)驗(yàn)歷經(jīng)多次檢測，最后選用106g/L亞鐵氰化鉀水溶液和219g/L乙酸鋅解決試品中蛋白實(shí)際效果最好。

（2）固相萃取柱的挑選

此次實(shí)驗(yàn)根據(jù)試品加標(biāo)回收開展調(diào)查，各自稱量呈陰性試品6份，每一份2.59，各高精密添加規(guī)范混和貯備液1.0mL，其他稱量破碎勻稱的點(diǎn)心試品2.5g置50mL離心管架中，加25mL水，各加5mL106g/L亞鐵氰化鉀水溶液和5mL219g/L乙酸鋅水溶液，渦流10min后，放水滴定劑至50mL，經(jīng)10000r/min冷藏離心式10min后取下，量取上清液5mL過QasisWAX固相萃取小柱（事先經(jīng)3mL工業(yè)甲醇及其3mL水活性），棄去排出液，先后用6mL2％苯甲酸和6mL純水系統(tǒng)清理，再用5％氨解工業(yè)甲醇過柱并搜集于15mL離心管架中，在40℃水浴中氮吹至近干后取下置放室內(nèi)溫度，用5mL水復(fù)溶沉渣，過0.45μmGHP微孔濾膜后，被測。

結(jié)果見表2，從結(jié)論還可以看得出，WatersOasisWAX固相萃取小柱利用率最大，對這次實(shí)驗(yàn)的13種食用添加劑聚集比較好，WatersOasisHLB固相萃取小柱和WatersOasisMCX固相萃取小柱利用率其次，緣故可能是，WatersOasisWAX固相萃取小柱特性為復(fù)合型弱陽離子互換正相反吸收劑，具備弱陽離子互換和非極性親水性雙向功效的混和吸收劑，對強(qiáng)酸堿性化學(xué)物質(zhì)具備高的目的性和敏感度，含弱堿性的胺基作用官能團(tuán)，適用從偏堿或中性化化學(xué)物質(zhì)中分離純化酸性物質(zhì)，可用以強(qiáng)酸堿性化學(xué)物質(zhì)的解決，此次實(shí)驗(yàn)的13種添加物均為水溶化學(xué)物質(zhì)，選用WAX開展聚集，2％苯甲酸清理可以將試樣中正離子狀況的雜物清理除去，再用5％氨解工業(yè)甲醇將聚集在固相萃取小柱分子結(jié)構(gòu)情況的食品添加劑開展離子化過柱出來；WatersOasisHLB內(nèi)的吸收劑是根據(jù)一個“獨(dú)特的旋光性捕捉官能團(tuán)”來提升對旋光性有機(jī)物的保存給予不錯的水浸潤性，用以酸堿性，中性化和偏堿化學(xué)物質(zhì)的通用性吸收劑，這類特性用以剖析人造黑色素很好的，可是這一小柱對添加劑中的納他霉素和富馬酸二甲酯的保存聚集實(shí)際效果較弱，緣故可能是HLB內(nèi)填充料是親脂化學(xué)物質(zhì)，而納他霉素和富馬酸-ep酯是吸水性的，WatersOasisMCX固相萃取小柱是復(fù)合型正離子互換正相反吸收劑，對偏堿化學(xué)物質(zhì)具備高的目的性和敏感度，MCX小柱對一部分黑色素和添加劑的聚集實(shí)際效果也非常差，不可以與此同時對13種成份開展剖析，故此次實(shí)驗(yàn)挑選WatersOasisWAX固相萃取小柱開展。