1.3方式

1.3.1DNA獲取

選用天根病菌基因DNA獲取檢測(cè)試劑盒獲取病菌基因，具體做法和流程參考檢測(cè)試劑盒使用說(shuō)明。所獲取的菌種DNA運(yùn)用核苷酸蛋白質(zhì)檢測(cè)儀和Qubit熒光定量檢測(cè)儀檢驗(yàn)基因DNA的純凈度和濃度值，并送北京市諾禾致源科技發(fā)展有限責(zé)任公司開(kāi)展全基因組測(cè)序。

1.3.2病菌全基因組測(cè)序及生物信息學(xué)剖析

經(jīng)電泳原理檢驗(yàn)達(dá)標(biāo)的DNA試品用超音波粉碎儀任意切斷成尺寸約為350bp的精彩片段，經(jīng)尾端修補(bǔ)、加A尾、加轉(zhuǎn)錄組測(cè)序連接頭、提純、PCR擴(kuò)增等流程進(jìn)行百度文庫(kù)制取。應(yīng)用Qubit2.0和Agilent2100對(duì)搭建好的百度文庫(kù)開(kāi)展基本定量分析和插進(jìn)精彩片段檢驗(yàn)。插進(jìn)精彩片段合乎期望后，應(yīng)用Q-PCR對(duì)百度文庫(kù)的合理濃度值開(kāi)展精確定量分析。百度文庫(kù)檢驗(yàn)達(dá)標(biāo)后選用北京市諾禾致源科技發(fā)展公司的IlluminaNovaSeq6000轉(zhuǎn)錄組測(cè)序系統(tǒng)軟件開(kāi)展全基因組測(cè)序。對(duì)illumina轉(zhuǎn)錄組測(cè)序服務(wù)平臺(tái)的信息開(kāi)展低品質(zhì)過(guò)慮，包含除去失效數(shù)據(jù)信號(hào)、除去轉(zhuǎn)錄組測(cè)序連接頭和錨定引物編碼序列、除去繁雜編碼序列和反復(fù)編碼序列，進(jìn)而得到優(yōu)質(zhì)的合理數(shù)據(jù)信息（CleanData）開(kāi)展后期剖析。應(yīng)用SOAPdenovo手機(jī)軟件開(kāi)展拼裝，用RAST對(duì)拼裝編碼序列開(kāi)展注解(http://rast.nmpdr.org)。應(yīng)用基因臨床流行病學(xué)核心（CenterforGenomicEpidemiology）CGE的默認(rèn)設(shè)置 閥值，對(duì)拼裝編碼序列開(kāi)展評(píng)定（http://www.genomicepidemiology.org），運(yùn)用ThePathosystemsResourceIntegrationCenter（PATRIC）對(duì)基因構(gòu)成開(kāi)展剖析（https://www.patricbrc.org/），運(yùn)用CGEVirulenceFinder在線數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)血清蛋白分析、MLST分析和感病遺傳基因開(kāi)展剖析。

1.3.3特征遺傳基因PCR檢驗(yàn)方式

將獲取的CMCC44841基因DNA定量分析后，各自開(kāi)展10倍梯度方向稀釋液，獲得10-1、10-2、10-3、10-4系列濃度值，參考GB4789.6-2016中引物設(shè)計(jì)編碼序列和PCR檢驗(yàn)方式 ，開(kāi)展astA、aggR、pic特征遺傳基因PCR擴(kuò)增和敏感度檢驗(yàn)，并且用1%瓊脂糖電泳電泳原理檢驗(yàn)PCR物質(zhì)。

1.3.4國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的生產(chǎn)制造制取

1.3.4.1EAEC菌體國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制取

取CMCC44841一代新鮮塑造物，畫(huà)線注射于TSA平板電腦，36℃塑造24h。用無(wú)菌棉簽從平板電腦上刮除菌體，添加到帶有海藻糖和胎牛血清的干凍保護(hù)膜中，渦流攪拌，用移液器汲取20μL在較低溫度下冷凍成小球，隨后于冷凍式干燥機(jī)中低溫干燥。將干凍后的菌球放置2mL的西林瓶中，運(yùn)用冷凍式干燥機(jī)開(kāi)展真空泵旋蓋密封性。最后制取成EAEC成分為103CFU/試品的菌球。

1.3.4.2EAECgDNA國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制取

將純凈度A260/A280為1.7的20µgDNA添加到20ml帶有聚糖的干凍保護(hù)膜中，用移液器汲取20μL在較低溫度下冷凍成小球，隨后于冷凍式干燥機(jī)中開(kāi)展低溫干燥，最后制取成成分為20ng/試品的菌球。將干凍后的菌球放進(jìn)2mL的西林瓶中，將橡膠塞子虛掩的蓋在西林瓶上，隨后用冷凍式干燥機(jī)開(kāi)展真空泵旋蓋。

1.3.5國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)勻稱性檢測(cè)

1.3.5.1EAEC菌體國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)勻稱性檢測(cè)

依據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)勻稱性科學(xué)研究提取試品總數(shù)規(guī)定，從制作的一批600瓶國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中隨機(jī)抽取20瓶試品，一瓶試品充足溶解1mL鹽水，應(yīng)用螺旋式施膠儀E50方式在TSA平板電腦上開(kāi)展螺旋式施膠，每一個(gè)試品兩個(gè)平行面。36℃塑造24h后對(duì)平板電腦開(kāi)展菌落計(jì)數(shù)。依據(jù)CNAS-GL003對(duì)記數(shù)結(jié)果開(kāi)展單因素方差分析，點(diǎn)評(píng)試品的勻稱性。

1.3.5.2EAECgDNA國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)勻稱性檢測(cè)

依據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)勻稱性科學(xué)研究提取試品總數(shù)規(guī)定，從制作的一批300瓶國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中隨機(jī)抽取10件試品，向一瓶國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)試品添加100μLddH2O，充足融解，制取成20ng/100μL濃度值的DNA試品，取2μL做為模版，參考GB4789.6-2016中引物設(shè)計(jì)編碼序列和PCR檢驗(yàn)方式 ，開(kāi)展astA、aggR、pic特征遺傳基因PCR擴(kuò)增。

1.3.6國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)穩(wěn)定性測(cè)試

1.3.6.1運(yùn)送可靠性

將制作的EAEC菌體國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和gDNA國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)各自儲(chǔ)存于25℃和37℃標(biāo)準(zhǔn)下，EAEC菌體國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)實(shí)驗(yàn)周期時(shí)間為7天，各自于1、3、5、7天提取3個(gè)試品，開(kāi)展含菌量測(cè)量。依據(jù)CNAS-GL003中｜-｜≤0.3σ規(guī)則對(duì)結(jié)論開(kāi)展可靠性點(diǎn)評(píng)。EAECgDNA國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)實(shí)驗(yàn)周期時(shí)間為14天，各自于1、3、5、7、14天提取3個(gè)試品，對(duì)特征遺傳基因開(kāi)展PCR擴(kuò)增，調(diào)查試品的運(yùn)送可靠性。

1.3.6.2貯藏可靠性

將制作的EAEC菌體國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)及gDNA國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)各自于-20℃、4℃標(biāo)準(zhǔn)下儲(chǔ)存兩個(gè)月。于4℃儲(chǔ)存7、14和28天，-20℃儲(chǔ)存28和六十天，各自提取3個(gè)試品開(kāi)展菌成分測(cè)量，于4℃和-20℃儲(chǔ)存28、45和六十天各自提取3個(gè)試品開(kāi)展特征基因檢查，調(diào)查試品的貯藏可靠性。依據(jù)CNAS-GL003中｜-｜≤0.3σ規(guī)則對(duì)EAEC國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)開(kāi)展可靠性點(diǎn)評(píng)。

1.3.7國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的合作認(rèn)證

應(yīng)用以上制取好的試品，依照我國(guó)藥品標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)物質(zhì)合作校準(zhǔn)實(shí)施辦法，發(fā)送給3家試驗(yàn)室，編碼各自為A、B和C，各家試驗(yàn)室接到10件試品，參考合作認(rèn)證安全操作規(guī)程對(duì)樣本中EAEC國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)以及gDNA國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)開(kāi)展檢測(cè)，包含菌落計(jì)數(shù)和特征基因檢查。

1.3.8國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)應(yīng)用實(shí)際效果認(rèn)證

依據(jù)GB29921-2013《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中致病菌限量》，挑選肉制品、奶粉、豆腐乳、曲奇餅干和薯?xiàng)l5種食品類栽培基質(zhì)共20份試品對(duì)EAEC國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的運(yùn)用作用實(shí)現(xiàn)認(rèn)證，試品信息內(nèi)容見(jiàn)表1。先將EAEC103CFU濃度值的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶解1mL鹽水中，每一件試品各稱量2份，25g/份，一份一切正常檢測(cè)，一份添加國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)100μL，依據(jù)GB4789.6-2016開(kāi)展實(shí)際操作。增菌后畫(huà)線分離出來(lái)平板電腦觀查是不是有典型性菌體生長(zhǎng)發(fā)育，并開(kāi)展PCR確定。