γ-氨基丁酸(GABA)是一種四碳非蛋白碳水化合物，是由磷酸脫羧酶不可逆、專一地將L-磷酸的α-羧基脫去-分子結(jié)構(gòu)CO₂獲得，是高寬比溶解水的兩性離子，pK值為4.03和10.56，因而主要表現(xiàn)出與此類碳水化合物相近的身理活力，即做為一種抑制型遞質(zhì)存有于哺乳類動(dòng)物的神經(jīng)中樞體系中?，F(xiàn)階段普遍使用于工業(yè)生產(chǎn)、寵物飼料、藥業(yè)和食品企業(yè)。

很多研究表明，GABA有有助于睡眠、提高記憶力、抗焦慮、防止和醫(yī)治癲癇、減緩腦變老、緩解毛細(xì)血管、調(diào)整生長(zhǎng)激素代謝、提升 受胎率、消除氨毒、提高肝臟功能等功效。

現(xiàn)階段制取GABA的辦法具體有綠色植物聚集法、有機(jī)合成法、生物發(fā)酵法、酶催化反應(yīng)法。綠色植物聚集法生產(chǎn)制造GABA盡管安全環(huán)保，但GABA濃度值低，尚沒法作為藥品、食用添加劑；有機(jī)合成法生產(chǎn)制造GABA安全系數(shù)較弱、有化工殘余，也不容易做到藥業(yè)及食品企業(yè)的規(guī)范：生物發(fā)酵法取得的GABA是一個(gè)多相繁雜管理體系，濃度值低，中下游物質(zhì)分離出來成本增加，是生產(chǎn)制造高純、濃度較高的GABA的一個(gè)發(fā)展瓶頸。因此 ，現(xiàn)階段制取GABA多選用酶催化反應(yīng)法，主要是使用微生物菌種體細(xì)胞內(nèi)分離出來獲得的磷酸脫羧酶或可以生產(chǎn)制造磷酸脫羧酶的微生物菌種體細(xì)胞專一、不可逆地脫下L-磷酸的α-羧基，進(jìn)而獲得濃度較高的、高純的GABA。此辦法的特點(diǎn)是反映標(biāo)準(zhǔn)柔和、不用高昂的原材料、耗能低，而且微生物菌種來源于的磷酸脫羧酶和可以生產(chǎn)制造磷酸脫羧酶的微生物菌種體細(xì)胞可利用簡(jiǎn)潔的細(xì)胞培養(yǎng)基很多獲得。

現(xiàn)階段大多數(shù)科學(xué)研究以大腸埃希菌為寄主表述GAD，催化反應(yīng)生產(chǎn)制造GABA。在資產(chǎn)重組菌發(fā)醇全過程中加上一定含量的輔酶磷酸吡哆醛(PLP)可以推動(dòng)GAD的伸縮，進(jìn)而提升 GAD酶魅力。此外，酶催化反應(yīng)法即運(yùn)用GAD將磷酸脫去一分子CO₂制取GABA全過程中，在酶轉(zhuǎn)換管理體系中加入一定量的PLP能夠推動(dòng)酶液或全體細(xì)胞的轉(zhuǎn)換舊。有學(xué)者報(bào)導(dǎo)了在大腸埃希菌發(fā)醇全過程中同時(shí)加上0.02mmol/LPLP后，GABA生產(chǎn)量是對(duì)比的2.0～2.5倍。可是PLP價(jià)格比較貴，在進(jìn)行發(fā)酵全過程和酶轉(zhuǎn)換管理體系中同時(shí)加上毫無疑問大大增加產(chǎn)品成本。因?yàn)榇竽c埃希菌本身具有吡哆醛蛋白激酶(PdxK)遺傳基因和硫酸銨吡哆醇抗霉素(PdxH)遺傳基因，進(jìn)而產(chǎn)生PLP挽救方式(見圖1)。輔酶磷酸激酶吡哆醇(PN)、吡哆胺(PM)和吡哆醛(PL)上57羥甲基根據(jù)PdxK使其磷酸化，轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的輔酶中問體硫酸銨吡哆醇(PNP)和硫酸銨吡哆胺(PMP)及其輔酶磷酸吡哆醛(PLP)，PdxH進(jìn)一步催化反應(yīng)PNP或PMP的氧化還原反應(yīng)，轉(zhuǎn)化成輔酶PLP，輔酶PLP的提升可推動(dòng)GAD的伸縮，提升 GAD酶魅力。黃燕等科學(xué)研究了在大腸埃希菌發(fā)醇全過程中加上PN后，酶活是對(duì)照實(shí)驗(yàn)(不加上PN)的1.8倍。

可是大腸埃希菌為非食品衛(wèi)生安全菌種，在進(jìn)行發(fā)酵全過程中容易造成類毒素，而且必須 加上價(jià)格比較貴且有侵害功效的IPTG做為誘導(dǎo)劑誘發(fā)產(chǎn)酶，其生產(chǎn)制造取得的GAD安全系數(shù)不高，間距達(dá)到食品類和制藥方面的需求也有一定差別?？莶菘莶菅挎呔歉鶕?jù)美國(guó)食品和藥物管理局GARS驗(yàn)證的安全性菌種，廣泛運(yùn)用在食品類、藥業(yè)制造中。殊不知在枯草枯草芽孢菌中缺乏PdxH，因此沒法運(yùn)用加上輔酶磷酸激酶PN的方法，根據(jù)PLP挽救方式將PN轉(zhuǎn)換為PLP，進(jìn)而提升 GAD酶魅力?，F(xiàn)階段，很多的科研集中化在以枯草枯草芽孢菌為寄主生產(chǎn)制造GAD，在酶轉(zhuǎn)換全過程中根據(jù)立即加上輔酶PLP提升 轉(zhuǎn)換高效率，如丁偉等應(yīng)用安全性寄主枯草枯草芽孢菌生產(chǎn)制造GABA，在其轉(zhuǎn)換全過程巾立即加上PLP，全體細(xì)胞催化反應(yīng)GABA生產(chǎn)量為239.91g/L，轉(zhuǎn)換率54.48％。因?yàn)镻LP價(jià)格比較貴，造成 產(chǎn)品成本較高，沒法融入工業(yè)生產(chǎn)要求。有關(guān)在枯草枯草芽孢菌為寄主生產(chǎn)制造GAD發(fā)醇全過程中，加上質(zhì)優(yōu)價(jià)廉的輔酶磷酸激酶以提升 GAD酶魅力的探究末見報(bào)導(dǎo)。因而創(chuàng)作者以枯草枯草芽孢菌(Bacillussubtilis)為寄主，根據(jù)基因工程技術(shù)將大腸埃希菌來源于的磷酸脫羧酶遺傳基因(gadB)在B.sMbtilis中異源表述，加上相對(duì)性便宜的輔酶磷酸激酶PL，根據(jù)PdxK受體的PLP挽救方式將其轉(zhuǎn)換轉(zhuǎn)化成PLP(見圖2)，進(jìn)而提升 酶活和生產(chǎn)量，減少產(chǎn)品成本。

1 原材料與方式

1.1 原材料

1.1.1 菌種和質(zhì)粒

質(zhì)粒EcoliJMl09/pET-24a( )-gadB為創(chuàng)作者所屬試驗(yàn)室早期搭建，菌種B.5Mbtilis和表達(dá)載體pHY300PLK(含啟動(dòng)子P_HfpaH和P_armyQ，沒有信號(hào)肽)由創(chuàng)作者所屬試驗(yàn)室儲(chǔ)存。

1.1.2 培養(yǎng)液

LB液體培養(yǎng)基(g/L)：各自稱量氧化鈉10g、發(fā)酵粉5g、蛋白胨10g，溶解1L雙蒸水中，并根據(jù)加上2mol/LNaOH或HCl調(diào)整pH至7.0。

LB固態(tài)瓊脂粉培養(yǎng)液：LB液體培養(yǎng)基中加上濃度值為20g/L的瓊脂粉。

高滲液體培養(yǎng)基：LB液體培養(yǎng)基巾加上0.5mol/L山梨糖醇。

電鉆培養(yǎng)液：LB液體培養(yǎng)基中分別加上0.5mol/L山梨糖醇和甘油果糖，濃度值為100g/L的葡萄糖水。

RM培養(yǎng)液：LB液體培養(yǎng)基中加上0.5mol/L山梨糖醇和0.38mol/L甘油果糖。

TB培養(yǎng)液(g/L)：各自稱量發(fā)酵粉24g、蛋白胨12g、凡士林5g、三水磷酸氫二鉀16.43g、磷酸二氫鉀2.31g，溶解1L雙蒸水中，并加上2mol/LNaOH或HCl調(diào)整pH至7.0。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑

pH至7.0。1.1.3實(shí)驗(yàn)試劑QuickcutHindⅢ約束性內(nèi)切酶：購(gòu)自TaKaRa生物技術(shù)技術(shù)性有限責(zé)任公司；2xphantaMaxMasterMix、ExnaseⅡ無縫連接檢測(cè)試劑盒：購(gòu)自諾唯贊(南京市)生物技術(shù)有限責(zé)任公司；DL-10000DNAMarker、氨芐青霉素、四環(huán)素：購(gòu)白寶生物有限責(zé)任公司；質(zhì)粒提取檢測(cè)試劑盒、瓊脂糖電泳DNA同收檢測(cè)試劑盒：購(gòu)白天根生化高新科技(北京市)有限責(zé)任公司

UnstainedProteinMWMarker標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)品、蛋白質(zhì)膠制取檢測(cè)試劑盒：購(gòu)自碧云天生物技術(shù)性有限責(zé)任公司：分子結(jié)構(gòu)級(jí)的蛋白胨和發(fā)酵粉：購(gòu)自美國(guó)Oxiod企業(yè)：別的基本實(shí)驗(yàn)試劑：購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)藥品有限責(zé)任公司。

1.1.4 關(guān)鍵儀器設(shè)備

PCR儀：購(gòu)自英國(guó)Bio-Rad公司：722型紫外線由此可見光度計(jì)：購(gòu)白上海儀電分析儀有限責(zé)任公司：冷藏式離心脫水機(jī)：購(gòu)自Beckmancoulter企業(yè)：KQ-250E型超音波體細(xì)胞破碎機(jī)：購(gòu)自寧波新芝生物技術(shù)股權(quán)有限責(zé)任公司；pH計(jì)：購(gòu)自法國(guó)Mettler-Toledo企業(yè)：高效率液相色譜：購(gòu)自安捷倫科技有限責(zé)任公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)

以質(zhì)粒pET-24a( )-gadB為模版，依據(jù)無縫拼接復(fù)制同宗臂設(shè)計(jì)原理各自設(shè)計(jì)方案正、反方向引物設(shè)計(jì)：正方向弓I物(F1)：57-GGAGTGTCAAGAATGGACCAGAAGCTGTTAACGGA-3'：反方向引物設(shè)計(jì)(R1)：5'-‘ITTATTACCAAGCTTTCAGGTGTGTTTAAAGCTGTTC-3’。

以質(zhì)粒pHY300PLK為模版，依據(jù)無縫拼接復(fù)制同宗臂設(shè)計(jì)原理各自設(shè)計(jì)方案正、反方向引物設(shè)計(jì)：
正方向引物設(shè)計(jì)(F2)：5'-TCAAATAAGGAGTGTCAAGAATG-3’：反方向引物設(shè)計(jì)(R2)：5’-GGTGTTTTTTTACCAAGCTT-3’。
將制定好的引物設(shè)計(jì)送至蘇州市金唯智生物技術(shù)公司生成。

1.2.2 目的基因和表達(dá)載體的獲得

以試驗(yàn)室儲(chǔ)存的質(zhì)粒pET-24a( )-gadB為模版，F(xiàn)1/R1為正反面向引物設(shè)計(jì)增加gadB目的基因；PCR反映管理體系(50μL)：5×PSBuffer10μL、ddH₂034μL、dNTP4μL、模版DNA0.5μL，正、反方向引物設(shè)計(jì)各0.5μL，PrimerSTARPolymerase0.5μL。

PCR程序流程：94℃預(yù)轉(zhuǎn)性5min，98℃轉(zhuǎn)性10S，55℃淬火5S。72℃拓寬2min，轉(zhuǎn)性至拓寬全過程開展29個(gè)循環(huán)系統(tǒng)：72℃拓寬10min；4℃儲(chǔ)存。

以質(zhì)粒pHY300PLK為模版，F(xiàn)2/R2為正反面向引物設(shè)計(jì)增加表達(dá)載體；PCR反映管理體系(50μL)：5×PSBuffer10μL、ddH₂O34μL、dNTP4μL、模版DNA0.5μL,正、反方向引物設(shè)計(jì)各0.5μL，PrimerSTARPolymerase0.5μL。

PCR程序流程：94℃預(yù)轉(zhuǎn)性5min，98℃轉(zhuǎn)性10s，55℃淬火5S，72℃拓寬6min，轉(zhuǎn)性至拓寬全過程開展29個(gè)循環(huán)系統(tǒng)：72℃拓寬10min；4℃儲(chǔ)存。

目的基因和表達(dá)載體PCR雜帶根據(jù)瓊脂糖核苷酸電泳原理開展認(rèn)證。

1.2.3 目的基因和表達(dá)載體的聯(lián)接與評(píng)定

1.2.2已認(rèn)證準(zhǔn)確的PCR物質(zhì)根據(jù)瓊脂糖疑膠同收檢測(cè)試劑盒開展回收利用?；厥绽煤蟮腜CR物質(zhì)用ExnaseⅡ連接酶聯(lián)接，其聯(lián)接管理體系如下所示：ddH₂O5.3μL、5×CEBuffer2μL、ExnaseⅡ1μL、表達(dá)載體1.16μL、目的基因0.54μL，放置PCR儀37℃反映30min進(jìn)行聯(lián)接。

選用大腸埃希菌JMl09熱擊轉(zhuǎn)化法后，將轉(zhuǎn)換細(xì)胞液施膠至含100μg/mL氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上，在37℃恒溫培養(yǎng)箱顛倒塑造10～12h，挑菌單菌體至含100μg/mL氨芐青霉素的10mLLB液體培養(yǎng)基中，放置振蕩培養(yǎng)箱37℃、200r/min塑造8～10h后搜集菌體，并獲取質(zhì)粒便于認(rèn)證和開展事后試驗(yàn)。將獲取的質(zhì)粒開展HindⅢ酶切認(rèn)證準(zhǔn)確后送到蘇州市金唯智生物技術(shù)有限責(zé)任公司轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。將轉(zhuǎn)錄組測(cè)序恰當(dāng)?shù)馁|(zhì)粒根據(jù)觸電轉(zhuǎn)化法導(dǎo)進(jìn)表述寄主B.Subtilis中，將轉(zhuǎn)換細(xì)胞液施膠至含20μg/mL四環(huán)素的LB共體培養(yǎng)液上，在37℃恒溫培養(yǎng)箱顛倒塑造10～12h，挑菌單菌體至含20μg/mL四環(huán)素的10mLLB液體培養(yǎng)基中，放置振蕩培養(yǎng)箱37℃、200r/min塑造8～10h后搜集菌體，并獲取質(zhì)粒開展酶切認(rèn)證。