2.9 免疫力機(jī)構(gòu)化學(xué)檢測(cè):

組織芯片經(jīng)脫臘凝固、消滅內(nèi)源過氧化氫酶、熱抗原修復(fù)和BSA封閉式后，Copine-3抗原1∶500稀釋液后滴邊加個(gè)集成ic，4℃孵育留宿。按GTVisionⅢ型免疫力組織化學(xué)診斷試劑盒表明實(shí)際操作，滴入HRP標(biāo)識(shí)的高聚物(抗兔/鼠)室內(nèi)溫度孵育40 min,DAB著色2 min，蘇木素復(fù)染5 min，飲用水清洗10 min返藍(lán)，硫酸酒精分裂10 s，脫干全透明后封片顯微鏡下查驗(yàn)。

結(jié)果

1．體細(xì)胞總RNA獲取及CPNE3基因擴(kuò)增

如圖所示1所顯示，應(yīng)用總RNA獲取檢測(cè)試劑盒獲取HBE的總RNA，經(jīng)1%瓊脂糖電泳電泳原理，數(shù)據(jù)顯示，3條RNA雜帶比較清楚、詳細(xì)，沒有顯著彌漫、溶解狀況，說明獲取的RNA品質(zhì)不錯(cuò)。

應(yīng)用任意引物設(shè)計(jì)將總RNA反轉(zhuǎn)錄為c DNA。以c DNA為模版，運(yùn)用生成的CPNE3遺傳基因非特異引物設(shè)計(jì)開展PCR擴(kuò)增。PCR物質(zhì)經(jīng)1%瓊脂糖電泳電泳原理，發(fā)生與預(yù)估相對(duì)分子質(zhì)量尺寸一致的雜帶(約1600 bp)。

2．重組質(zhì)粒p EGFP-N1-CPNE3的搭建及評(píng)定

重組質(zhì)粒p EGFP-N1-CPNE3經(jīng)XhoⅠ和Bam HⅠ雙酶切后，經(jīng)1%瓊脂糖電泳電泳原理后，在其中1條精彩片段(約1600 bp)與目的基因尺寸一致，另1條精彩片段(約5000 bp)與p EGFP-N1質(zhì)粒雙酶切后尺寸一致(圖2)。

對(duì)重組質(zhì)粒開展DNA測(cè)序，結(jié)果經(jīng)分子伴侶序列比對(duì)搜索器(basic local alignment search tool,BLAST)核對(duì)，插進(jìn)精彩片段與目地遺傳基因編碼序列一致。說明取得成功搭建了重組質(zhì)粒p EGFP-N1-CPNE3。

3．瑩光倒置顯微鏡觀查

轉(zhuǎn)染體細(xì)胞48 h后，于瑩光倒置顯微鏡下觀查，各自轉(zhuǎn)染p EGFP-N1質(zhì)粒的對(duì)照實(shí)驗(yàn)和p EGFP-N1-CPNE3重組質(zhì)粒的對(duì)照組體細(xì)胞均有翠綠色瑩光。說明質(zhì)粒轉(zhuǎn)染體細(xì)胞取得成功并表述EGFP(圖3)。

4．激光器掃描儀共焦顯微鏡觀查

p EGFP-N1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的293T和H1299體細(xì)胞中，EGFP在人體細(xì)胞內(nèi)表述遍布勻稱;重組質(zhì)粒p EGFP-N1-CPNE3轉(zhuǎn)染的體細(xì)胞，在激光器掃描儀共焦顯微鏡下能夠觀測(cè)到，翠綠色的Copine-3-EGFP與鮮紅色的GAPDH，及其深藍(lán)色的DAPI均有重疊，說明Copine-3-EGFP融合蛋白定坐落于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)(圖4)。

5．顯微鏡觀查

各自搜集一切正常塑造的293T和H1299體細(xì)胞，按流程2.7實(shí)際操作，在添加抽提實(shí)驗(yàn)試劑B解決前后左右各自抽樣經(jīng)結(jié)晶體紫上色后顯微鏡下觀查。添加抽提實(shí)驗(yàn)試劑B前，細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)詳細(xì)，可觀測(cè)到完全的體細(xì)胞;添加抽提實(shí)驗(yàn)試劑B后，細(xì)胞質(zhì)在低滲透濃度標(biāo)準(zhǔn)下澎漲裂開，詳細(xì)的細(xì)胞質(zhì)被提取(圖5)。說明該辦法適用胞質(zhì)蛋白質(zhì)和胞核蛋白的分離出來。

6. Western blotting檢驗(yàn)Copine-3基因表達(dá)

各自獲取轉(zhuǎn)染p EGFP-N1-CPNE3重組質(zhì)粒的293T和H1299體細(xì)胞的胞質(zhì)蛋白質(zhì)和細(xì)胞質(zhì)胞核蛋白，開展Western blotting檢驗(yàn)。骨架蛋白β-actin和組蛋白Histon H一分別在胞質(zhì)蛋白質(zhì)和胞核蛋白中被檢驗(yàn)到;在胞質(zhì)蛋白質(zhì)和胞核蛋白中都檢驗(yàn)到Copine-3蛋白質(zhì)。說明Copine-3蛋白質(zhì)在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中都有表述(圖6)。

7．免疫力組織化學(xué)觀查

對(duì)肺癌機(jī)構(gòu)臨床醫(yī)學(xué)試品開展免疫力機(jī)構(gòu)化學(xué)檢測(cè)，結(jié)果如圖所示7，箭頭符號(hào)所顯示，細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中都有深棕色著色，Copine-3蛋白質(zhì)定坐落于體細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞質(zhì)。