1前言

綠色植物細菌病蟲害是導(dǎo)致農(nóng)業(yè)產(chǎn)品耗損的首要緣由之一，在現(xiàn)實制造中產(chǎn)生了無法估量的財產(chǎn)損失。病菌浸染主莖后，使糧食作物部分或整棵感病，危害植物生長發(fā)育，比較嚴重時導(dǎo)致主莖身亡，造成 農(nóng)業(yè)產(chǎn)品生產(chǎn)量減少，質(zhì)量降低。大部分病菌不但能在植物生長發(fā)育歷程中危害主莖情況，仍在農(nóng)業(yè)產(chǎn)品的輸送全過程中導(dǎo)致商品易腐爛，是導(dǎo)致蔬菜水果運送耗損的首要緣故。除此之外，一部分細菌病菌可以代謝真菌毒素，服用帶有真菌毒素的蔬菜水果可以造成 畸胎或引起癌病，威協(xié)人們身心健康。如多種多樣鏈格孢造成的鏈格孢內(nèi)毒素及其多種多樣曲霉造成的伏馬菌素B。

幾丁質(zhì)，是由N-酰胺基-D-葡萄糖胺（N-acetyl-D-glucosamine，GlcNAc）單個根據(jù)β-1，4-糖苷鍵聯(lián)接的高聚物，也是病源真菌細胞壁的主要成分。在絲狀真菌中，幾丁質(zhì)和別的聚糖成分占細胞壁成分的70%之上，在一部分酵母菌中，幾丁質(zhì)成分乃至做到細胞干重的10%～20%。幾丁質(zhì)酶能夠根據(jù)外切和/或內(nèi)切圓核糖核苷酸功效將幾丁質(zhì)裂化為GlcNAc或GlcNAc的可溶寡聚體。因而，以幾丁質(zhì)做為分子結(jié)構(gòu)靶點，根據(jù)幾丁質(zhì)酶的水解作用來完成植物病害預(yù)防是植物病害操縱的重要途徑。而害蟲防治因素代謝植物細胞裂化酶，裂化病源真菌細胞壁，也變成害蟲防治微生物菌種拮抗作用綠色植物病源細菌的具體體制之一。

排風(fēng)管菌（Bjerkanderaadusta）歸屬于非褶菌目，多孔結(jié)構(gòu)菌科，排風(fēng)管菌屬?，F(xiàn)階段，針對排風(fēng)管菌（Bjerkanderaadusta）的分析主要是聚集在環(huán)境生態(tài)工程行業(yè)，但仍不缺排風(fēng)管菌對綠色植物細菌病蟲害整治的分析報導(dǎo)。1982年，Dománski發(fā)覺排風(fēng)管菌可以抑止櫟樹（Quercusrobur）褐腐病的產(chǎn)生。2011年，Bak等研究發(fā)現(xiàn)了排風(fēng)管菌對歐美國家黑楊（Populuseuramericana）干腐病具備防治工作能力；2015年，汪華等挑選出一株對水稻紋枯病菌或瓜亡革菌（Thanatephoruscucumeris）、大麗輪枝菌（Verticilliumdahliae）、茄科羅爾氏菌（Ralstoniasolanacearum）等造成的植物病害具備非常好防效的排風(fēng)管菌M-1；2017年，Zhang等研究發(fā)現(xiàn)排風(fēng)管菌可以合理的抑止西瓜蔓枯病原菌（Didymellabryoniae），并在2018年初次研究了排風(fēng)管菌對核盤菌的抑制效果以及對油菜菌核?。⊿clerotiniasclerotiorum）的防效。但現(xiàn)階段，依然欠缺排風(fēng)管菌害蟲防治體制科學(xué)研究。本科學(xué)研究融合抗病性實際效果和RT-qPCR剖析，初次從排風(fēng)管菌中挑選并復(fù)制出一個幾丁質(zhì)酶遺傳基因，并根據(jù)外源性表述證實了該酶的抗真菌藥活力。推斷該遺傳基因是排風(fēng)管菌充分發(fā)揮生防功效歷程中的植物細胞裂化酶遺傳基因。

2原材料與方式

2.1原材料

本氏煙（Nicotianabenthamiana）。

排風(fēng)管菌（Bjerkanderaadusta）菌種BK-1從四川省馬爾康市土壤層中得到，儲藏于本試驗室，ITS系列號為MW182414（NCBI）。鏈格孢（Alternariaalternata）菌種CD-1，鏈格孢iPhone?；停ˋlternariaalternataf.sp.mali）L-1，細極鏈格孢（Alternariatenuissima）SCAU-1和灰紅提孢（Botrytiscinerea）DY-1均為本試驗室儲藏菌苗。尖孢鐮刀菌（Fusariumoxysporum）（BNCCNO.143078），茄鏈格孢（Alternariasolani）（BNCCNO.337910）購自北納生物（BeNaCultureCollection，BNCC）。

PCR引物設(shè)計見表1及表2。

2.2方式

2.2.1排風(fēng)管菌抗病性工作能力剖析

將灰紅提孢，鏈格孢和細極鏈格孢接轉(zhuǎn)到PDA培養(yǎng)液中25℃活性塑造7d，應(yīng)用外徑為5mm的打孔器割除真菌瓊脂塊做為接種物；排風(fēng)管菌活性塑造7d后，將五個直徑為5mm的排風(fēng)管菌真菌瓊脂塊注射至液態(tài)的100mLPDB培養(yǎng)液中25℃，180r/min活性塑造7d后應(yīng)用破碎機粉碎，做成排風(fēng)管菌真菌懸浮液做為抗菌液（AntiL）預(yù)留。

石蠟切片試驗：從生長發(fā)育30d的香煙主莖上裁取身心健康的香煙葉子水流清洗10min，應(yīng)用保鮮袋封死葉莖創(chuàng)口處，置放于無菌水淋濕的三層過濾紙上，在主葉柄兩邊對稱性部位各自擦抹50μL無菌水和排風(fēng)管菌真菌懸浮液后注射病菌真菌瓊脂塊做為對照實驗和對照組，每一組6反復(fù)。再將葉子和過濾紙放進頂層張口的塑料盒子中，頂層應(yīng)用保鮮袋密封維持盒里潮濕。將其放置溫室大棚內(nèi)（23℃，16h陽光照射；18℃，8h黑喑），維持48h（細極鏈格孢浸染96h）后對香煙葉子開展拍攝紀錄。

活體實驗：選擇身心健康的香煙主莖，將從上至下第4片葉子做為注射目標，接種方法同離體試驗。將注射后的主莖置放在密閉式，透光性且潮濕的育苗盆內(nèi)，溫室大棚塑造48h（細極鏈格孢浸染96h）后照相紀錄。

以上試驗最少反復(fù)2次，并應(yīng)用ImageJ開展葉子感病總面積統(tǒng)計分析。

2.2.2生物信息學(xué)剖析

參照該菌種基因有關(guān)信息（NCBIBioProjectID：PRJNA667319），應(yīng)用SignalPv5.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）對其幾丁質(zhì)酶遺傳基因和β-1，3-甘酶遺傳基因開展信號肽預(yù)測分析；并在NCBI數(shù)據(jù)庫查詢（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）對幾丁質(zhì)酶的傳統(tǒng)結(jié)構(gòu)域開展核對。

2.2.3僵持塑造及RT-qPCR剖析

將6種病源細菌和排風(fēng)管菌注射到PDA培養(yǎng)液中，25℃遮光情況下活性塑造5d，應(yīng)用打孔器取各菌體邊沿處直徑為5mm的菌塊。各自將排風(fēng)管菌和一種病菌注射到新的PDA培養(yǎng)液中，各間距平板電腦邊沿2cm，并使兩菌塊維持在同一直徑網(wǎng)上25℃遮光塑造。

應(yīng)用細菌RNA迅速抽提檢測試劑盒（生工），獲取僵持塑造研究中注射后第六d互相觸碰地區(qū)真菌的RNA，應(yīng)用EasyScript©One-StepgDNARemovalandcDNASynthesisSuperMix（全式金）開展反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA.以cDNA為模版，以18SrRNA做為參照遺傳基因，應(yīng)用2×T5FastqPCRMix（SYBRGreenII）檢測試劑盒（擎科）對預(yù)測分析具備信號肽構(gòu)造的幾丁質(zhì)酶遺傳基因和β-1，3-甘酶遺傳基因開展表述量測量。

2.2.4排風(fēng)管菌幾丁質(zhì)酶遺傳基因BaCHIB復(fù)制

應(yīng)用高保真音響酶1-5TM2×Hight-FidelityMasterMix（MCLAB）增加除去信號肽區(qū)間的幾丁質(zhì)酶遺傳基因BaCHIB-T，并在C端加上6×His蛋白純化標識。以排風(fēng)管菌cDNA為原始模版，事后PCR全過程先后應(yīng)用上一步增加物質(zhì)為模版，獲得目地精彩片段BaCHIB-T，實際引物設(shè)計如下所示：①.BaCHIB-Cl-F/R；②.BaCHIB-Cl-F和His1-R；③.BaCHIB-Cl-F和His2-R；④.EcoRⅠ-T-F和NotⅠ-R。

應(yīng)用約束性內(nèi)切酶EcoRⅠ和NotI解決媒介pPIC9K.運用同源重組檢測試劑盒（諾唯贊）將BaCHIB-T與歸一化處理的媒介同源重組獲得資產(chǎn)重組媒介pPIC9K-BaCHIB-T（圖1），轉(zhuǎn)錄組測序恰當?shù)谋磉_載體應(yīng)用約束性內(nèi)切酶salⅠ歸一化處理，冰醋酸鋰轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)換畢赤酵母（Pichiapastoris）GS115菌種。

2.2.5重組蛋白的體現(xiàn)和提純及抗真菌藥活力

蛋白質(zhì)的體現(xiàn)和提純依照Deng等的辦法開展，并做好改善。資產(chǎn)重組媒介的表述菌種經(jīng)0.5%的工業(yè)甲醇誘發(fā)5d，同樣解決的滿載轉(zhuǎn)換菌種用以對照實驗。先后應(yīng)用帶有80，100，120，140mmol/L咪唑的聚磷酸鹽緩沖溶液（PBS）過柱與柱融合的總體目標蛋白質(zhì)。目地雜帶經(jīng)SDS-PAGE電泳原理檢驗。幾丁質(zhì)酶活力測量應(yīng)用幾丁質(zhì)酶活力診斷試劑盒（索萊寶）。

提純后的重組蛋白，濃度值調(diào)節(jié)為200μg/mL開展抗真菌藥活力檢驗。從活性5d的鏈格孢，茄鏈格孢和灰紅提孢的平板電腦邊沿割除二塊周長約為5～10mm的方形真菌瓊脂塊，并將其放置2mL離心管架中。每管添加400μL提純蛋白質(zhì)水溶液做為對照組，相等蛋白質(zhì)過柱液做為對照實驗25℃暗塑造48h后，觀查真菌生長發(fā)育情況。