3結(jié)果與剖析

3.1排風(fēng)管菌的抵抗工作能力剖析

以香煙為宿主，檢測(cè)排風(fēng)管菌對(duì)由灰紅提孢造成的灰霉病，由鏈格孢造成的赤星病和黑斑病的控制實(shí)際效果開展抗病性基因型試驗(yàn)（表3）。結(jié)果顯示，在石蠟切片和活物標(biāo)準(zhǔn)下，排風(fēng)管菌可以使灰霉病病斑總面積各自降低91.97%和100%；使赤星病病斑總面積降低77.12%和75.03%。而在黑斑病的對(duì)照組中，石蠟切片標(biāo)準(zhǔn)下并沒有觀查到顯著的抗病性實(shí)際效果；活物注射病菌時(shí)，反復(fù)多次未監(jiān)測(cè)到顯著病發(fā)征兆。

香煙灰霉病、香煙赤星病和香煙黑斑病各自由灰紅提孢、鏈格孢和細(xì)極鏈格孢造成香煙葉子的病斑總面積精確測(cè)量后，被用于較為排風(fēng)管菌對(duì)以上三種病蟲害的抵抗工作能力數(shù)據(jù)信息應(yīng)用單要素方差分析，“*”表明差別明顯（P<0.001）。

3.2生物信息學(xué)剖析

對(duì)該菌種的基因開展剖析，發(fā)覺排風(fēng)管菌該菌種具備11個(gè)幾丁質(zhì)酶遺傳基因，12個(gè)β-1，3-甘酶遺傳基因。在其中五個(gè)幾丁質(zhì)酶遺傳基因（EVM0010419；EVM0005032；EVM0003995；EVM0003825；EVM0009013）和3個(gè)β-1，3-甘酶遺傳基因（EVM0006890；EVM0003791；EVM00010135）所相對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)編碼序列N端具備信號(hào)肽構(gòu)造排風(fēng)管菌幾丁質(zhì)酶遺傳基因的傳統(tǒng)結(jié)構(gòu)域分析表明，排風(fēng)管菌幾丁質(zhì)酶遺傳基因均歸屬于GH18基因家族。除此之外，EVM0005032和EVM0003825尾端含有Chic_BD（aromaticchitin/cellulosebindingsiteresidues）構(gòu)造，歸屬于B類幾丁質(zhì)酶（CHIB）。

3.3幾丁質(zhì)酶遺傳基因和β-1，3-甘酶基因表達(dá)譜分析

RT-qPCR剖析僵持塑造第六d的排風(fēng)管菌植物細(xì)胞裂化酶基因表達(dá)水準(zhǔn)結(jié)果顯示在該環(huán)節(jié)，好幾個(gè)基因的表達(dá)量上漲，如幾丁質(zhì)酶遺傳基因EVM0005032，EVM0003825和EVM0009013，β-1，3-甘酶遺傳基因EVM0006890（圖2）。尤其是幾丁質(zhì)酶遺傳基因EVM60005032（BaCHIB），在與鏈格孢、茄鏈格孢、灰紅提孢和尖孢鐮刀菌的僵持塑造時(shí)，該遺傳基因各自上漲表述27.3倍、31.7倍、50.3倍和41.3倍（圖2B），但在與鏈格孢iPhone?；秃图?xì)極鏈格孢相互影響時(shí)，該遺傳基因未產(chǎn)生對(duì)應(yīng)的上漲表述。整體上看來(lái)，除遺傳基因EVM0005032外，其他遺傳基因上漲的情形主要是聚集在排風(fēng)管菌與茄鏈格孢和尖孢鐮刀菌的僵持塑造中，如遺傳基因EVM0009013和EVM0006890在解決茄鏈格孢時(shí)表述上漲（圖2e，2f）。此外，同為B類幾丁質(zhì)酶遺傳基因的EVM0003825僅在與尖孢鐮刀菌的僵持塑造中發(fā)生顯著的上漲表述（圖2d）。

3.4幾丁質(zhì)酶BaCHIB的抗真菌藥活力

應(yīng)用鎳柱對(duì)重組蛋白BaCHIB開展了分離純化，在咪唑濃度值為80mmol/L時(shí)目地蛋白質(zhì)能被高效率過柱，并在之后的SDS-PAGE中表明為單一雜帶（圖3）。尺寸在50～70kD中間，與預(yù)測(cè)分析分子結(jié)構(gòu)大小63.6kD相仿。對(duì)凈化后的重組蛋白開展活力測(cè)量，在37℃下幾丁質(zhì)酶活力約為17.7U/mg。

對(duì)幾丁質(zhì)酶BaCHIB開展抗真菌藥活力檢測(cè)，經(jīng)48h溫育，相比于對(duì)照實(shí)驗(yàn)，加上BaCHIB的對(duì)照組中，鏈格孢、茄鏈格孢和灰紅提孢均無(wú)新生兒真菌生長(zhǎng)發(fā)育的印痕，主要表現(xiàn)出突出的生長(zhǎng)發(fā)育抑制效果。

圖2注射6d后排風(fēng)管菌預(yù)測(cè)分析具備信號(hào)肽構(gòu)造的植物細(xì)胞裂化酶遺傳基因相對(duì)性表述量分析將排風(fēng)管菌獨(dú)立塑造做為對(duì)照實(shí)驗(yàn)；A1為鏈格孢；A2為鏈格孢iPhone?；?；A3為茄鏈格孢；A4為細(xì)極鏈格孢；B灰紅提孢；F為尖孢鐮刀菌.依據(jù)多重比較結(jié)果，不一樣英文字母表明差別明顯（P≤0.05）。

圖3重組蛋白BaCHIB的提純

4探討

本分析根據(jù)石蠟切片和活體實(shí)驗(yàn)，證實(shí)了排風(fēng)管菌對(duì)香煙灰霉病和赤星病具備優(yōu)良的抗病性實(shí)際效果。但在香煙黑斑病的石蠟切片浸染4d后，排風(fēng)管菌使用是否對(duì)病發(fā)總面積并無(wú)顯著危害，表明在石蠟切片標(biāo)準(zhǔn)下排風(fēng)管菌對(duì)香煙黑斑病沒有抗病性實(shí)際效果，而在活體實(shí)驗(yàn)中，對(duì)照組和對(duì)照實(shí)驗(yàn)均沒病斑的產(chǎn)生，該狀況很有可能因?yàn)椴捎玫募?xì)極鏈格孢菌種浸染工作能力較差，造成 浸染后沒什么感覺病基因型發(fā)生。

生防微生物菌種根據(jù)代謝植物細(xì)胞裂化酶抑止病菌的發(fā)育是其充分發(fā)揮生防功效的具體體制之一，如幾丁質(zhì)酶，β-1，3-甘酶，淀粉酶和胰蛋白酶，這種酶體一般在毀壞病原菌的植物細(xì)胞中起著非常重要的功效。為了更好地基本研究排風(fēng)管菌植物細(xì)胞裂化酶在排風(fēng)管菌抗病性中的功效，本分析利用生物信息學(xué)和RT-qPCR的方向考慮，對(duì)排風(fēng)管菌一部分植物細(xì)胞裂化酶開展剖析。

GH18大家族普遍出現(xiàn)于原核生物，真核生物甚至病毒感染中。依照結(jié)構(gòu)域差別可分成兩類：ClassIII（B類）和ClassV（A類）。在其中B類幾丁質(zhì)酶帶有幾丁質(zhì)或含糖量融合結(jié)構(gòu)域，這類幾丁質(zhì)酶關(guān)鍵參加細(xì)菌成長(zhǎng)發(fā)育歷程中的養(yǎng)分消化吸收，并在纖毛蟲和一部分細(xì)菌內(nèi)寄生蟲類的環(huán)節(jié)中起到主要功效。除此之外，此類幾丁質(zhì)酶基因結(jié)構(gòu)與綠色植物幾丁質(zhì)酶遺傳基因類似，而后面一種一般與寄主植物對(duì)病源病菌，細(xì)菌及纖毛蟲的抵抗性有關(guān)。從而可推斷，排風(fēng)管菌幾丁質(zhì)酶遺傳基因EVM0005032（BaCHIB）和EVM0003825很有可能在排風(fēng)管菌對(duì)病源細(xì)菌的害蟲防治中起到至關(guān)重要的分子生物學(xué)功效。

圖4資產(chǎn)重組幾丁質(zhì)酶BaCHIB的抗真菌藥活力三角形標(biāo)志標(biāo)示瓊脂塊，箭頭圖標(biāo)標(biāo)示病源細(xì)菌新生兒真菌。

應(yīng)用RT-qPCR對(duì)預(yù)測(cè)分析具備信號(hào)肽構(gòu)造的幾丁質(zhì)酶遺傳基因和β-1，3-甘酶基因表達(dá)譜開展深入分析測(cè)量，借此機(jī)會(huì)挑選出很有可能具備抗真菌藥活力的植物細(xì)胞裂化酶遺傳基因。在僵持塑造操作過程中，好幾個(gè)遺傳基因在注射6d后表述量上漲，尤其是，幾丁質(zhì)酶遺傳基因EVM0005032。結(jié)果顯示一部分綠色植物念珠菌性病源，如鏈格孢，茄鏈格孢，尖孢鐮刀菌和灰紅提孢，可以立即誘發(fā)排風(fēng)管菌植物細(xì)胞裂化酶基因表達(dá)。這一結(jié)論與Banani等的科學(xué)研究類似，桃梅奇酵母菌（Metschnikowiafructicola）菌種AP47在桃褐腐病原菌（Moniliniafructicola）植物細(xì)胞提取液誘發(fā)下，其幾丁質(zhì)酶遺傳基因MfChi上漲表述14倍，并在之后的試驗(yàn)中體現(xiàn)出水蜜桃褐腐病的明顯抑止工作能力。除此之外，Essghaier等在科學(xué)研究一種嗜鹽菌對(duì)草莓灰霉病的預(yù)防全過程中，發(fā)覺枯草枯草芽孢菌可以代謝各種具備抗真菌藥活力的抗氧化物：幾丁質(zhì)酶，β-1，3-甘酶，纖維素酶和胰蛋白酶；Urbina等在其科學(xué)研究中也發(fā)覺橄欖假絲酵母代謝的一種β-1，3-甘酶對(duì)iPhone病菌拓展青霉具備拮抗作用工作能力。以上科學(xué)研究為排風(fēng)管菌幾丁質(zhì)酶BaCHIB具備抗真菌藥活力的如果給予了相對(duì)的根據(jù)。另一方面，同歸屬于B類幾丁質(zhì)酶的遺傳基因EVM0003825，僅在排風(fēng)管菌與尖孢鐮刀菌的僵持塑造中發(fā)生上漲表述，而未發(fā)生類似BaCHIB在解決多種多樣病源細(xì)菌時(shí)的高表述狀況，這一結(jié)果表明，幾丁質(zhì)酶遺傳基因BaCHIB很有可能在解決病源細(xì)菌具備一定的非特異。

融合抗病性實(shí)際效果與幾丁質(zhì)酶遺傳基因BaCHIB的誘發(fā)表述剖析，說(shuō)明排風(fēng)管菌對(duì)綠色植物細(xì)菌病蟲害抗病性主要表現(xiàn)與BaCHIB的誘發(fā)表述狀況的發(fā)生高寬比同歩。如排風(fēng)管菌對(duì)香煙灰霉病和赤星病具備抗病性工作能力，幾丁質(zhì)酶遺傳基因BaCHIB在與灰紅提孢和鏈格孢的僵持塑造中發(fā)生誘發(fā)表述；對(duì)香煙黑斑病沒有明顯的抗病性實(shí)際效果，BaCHIB不發(fā)生明顯的誘發(fā)表述。這一結(jié)果為幾丁質(zhì)酶遺傳基因BaCHIB在排風(fēng)管菌的害蟲防治中起到主要功效給予了又一重要直接證據(jù)。

根據(jù)真核外源性表述系統(tǒng)軟件，排風(fēng)管菌幾丁質(zhì)酶BaCHIB可以被取得成功表述和提純。并呈現(xiàn)出幾丁質(zhì)酶活力和較好的抗真菌藥活力。這一結(jié)果證實(shí)了幾丁質(zhì)酶BaCHIB具備抗真菌藥工作能力在Ahmed等的分析中，翠綠色木霉幾丁質(zhì)酶在含量為2.23mg/mL時(shí)，對(duì)尖孢鐮刀菌塑造5d后的抗菌工作能力為45%；而另一種來(lái)源于珊瑚礁革蘭陰性桿菌的幾丁質(zhì)酶，在含量為0.15mg/mL和0.75mg/mL時(shí)，對(duì)稻瘟病菌分生孢子出芽抑制率各自在40%和10%上下；而來(lái)自哈茨木霉的幾丁質(zhì)酶Chit46，在含量為3.9μg/mL時(shí)，對(duì)灰紅提孢塑造5d后的成長(zhǎng)抑止工作能力為76%，主要表現(xiàn)出較以上二種幾丁質(zhì)酶更加高效率的抗菌工作能力在本分析中，三種病源細(xì)菌在0.2mg/mL的幾丁質(zhì)酶水溶液中塑造2d后，新生兒真菌生長(zhǎng)發(fā)育被明顯抑止，證實(shí)排風(fēng)管菌幾丁質(zhì)酶BaCHIB一樣具備不錯(cuò)的抗真菌藥工作能力。

本試驗(yàn)結(jié)果顯示，具備生防工作能力的排風(fēng)管菌BK-1可能是根據(jù)代謝幾丁質(zhì)酶BaCHIB完成其對(duì)一些綠色植物細(xì)菌病蟲害的抑止，但主要的害蟲防治體制，依然必須在這個(gè)基礎(chǔ)上實(shí)現(xiàn)更為深層次的科學(xué)研究。