β-甘露聚糖酶是一類可以水解反應(yīng)以β-1，4-D-吡喃甘露糖為主導(dǎo)鏈的內(nèi)切圓核糖核苷酸的統(tǒng)稱，歸屬于木質(zhì)素抗氧化物，普遍出現(xiàn)于大自然。微生物菌種是工業(yè)化生產(chǎn)甘露聚糖酶的具體來源于，真菌和細(xì)菌全是造成甘露聚糖酶的關(guān)鍵微生物菌種，在其中病菌是產(chǎn)β-甘露聚糖酶的最大的人群。甘露聚糖酶有普遍的使用使用價(jià)值，在食品工業(yè)、造紙工業(yè)、養(yǎng)殖業(yè)、石油開采以及它行業(yè)都是有輝煌的應(yīng)用前景。近些年，伴隨著在我國畜牧業(yè)養(yǎng)殖行業(yè)的迅速發(fā)展趨勢(shì)，甘露聚糖酶做為第三代精飼料酶變成了科學(xué)研究的網(wǎng)絡(luò)熱點(diǎn)。

在飼料廠中加上β-甘露聚糖酶可推動(dòng)營養(yǎng)元素的消化，減少生物的養(yǎng)分新陳代謝和養(yǎng)分耗費(fèi)，提升精飼料轉(zhuǎn)換率；改進(jìn)腸道微生態(tài)自然環(huán)境，提高小動(dòng)物免疫能力；推動(dòng)性激素的代謝，加速成長速率；提高低品質(zhì)精飼料的營養(yǎng)成分等。殊不知一般β-甘露聚糖酶的耐堿性較弱，無法在小動(dòng)物胃腸自然環(huán)境下充分發(fā)揮，因而找尋具備耐堿性的β-甘露聚糖酶是根本所在。

本試驗(yàn)以耐堿性做為挑選指標(biāo)值，從魔芋種植土壤層中篩分獲得耐堿性的β-甘露聚糖酶的造成菌，對(duì)該菌的發(fā)醇情況開展基本提升，為后期科學(xué)研究帶來基本。

一、原材料和方式

1、原材料

（1）試品來源于

土壤層試品收集自重慶奉節(jié)縣黃國民黨魔芋種植場(chǎng)。

（2）培養(yǎng)液(按質(zhì)量濃度計(jì))

聚集培養(yǎng)液：酵母菌浸粉0.5%、魔芋精粉1.5%、NaC10.5%、蛋白胨0.3%、pH7.2～7.4，115℃殺菌30min。

挑選培養(yǎng)液：NH4C10.5%、NaC10.5%、甘露聚糖1.0%、瓊脂粉2.0%、pH7.2～7.4，115℃殺菌30min。

種籽培養(yǎng)液：魔芋精粉1.0%、蛋白胨0.5%、NaCl1.0%、當(dāng)然pH，115℃殺菌30min。

原始發(fā)醇培養(yǎng)液：魔芋精粉2.0%、蛋白胨1.0%、NaCI1.0%、當(dāng)然pH，115℃殺菌30min。

2、菌種挑選

土壤層預(yù)備處理后開展聚集塑造，用梯度方向稀釋液法解決聚集細(xì)胞培養(yǎng)液并施膠在挑選培養(yǎng)液上，選擇漲勢(shì)較好且菌體直徑大的單菌體開展畫線分離出來，提純?nèi)沃?，斜?℃儲(chǔ)存。

將分離純化獲得的菌種開展搖瓶發(fā)醇，發(fā)醇后離心式獲得粗酶液。粗酶液用pH4、0.2mo/L磷酸氫二鈉一檸檬酸鈉緩沖溶液37℃、150r/min耐酸性解決1h，完用DNS測(cè)定方法粗酶液酶活，挑選酶魅力較大的菌種為供試菌。

3、酶魅力測(cè)量

取粗酶液0.1mL，加至0.9mL槐豆膠水溶液(0.5g槐豆膠 100mL、pH6.0、0.2mol/L磷酸緩沖液)試管嬰兒中，55℃的水浴反映10min。在試管嬰兒中添加lmLDNS實(shí)驗(yàn)試劑，開水浴5min消滅和著色，后水流制冷，滴定劑至10mL。以空缺液調(diào)零，在540nm處測(cè)其OD值。在甘露糖標(biāo)曲(參照張聞的辦法制取)上查出來相對(duì)應(yīng)的甘露糖成分，測(cè)算甘露聚糖酶酶活。

酶魅力界定：1個(gè)酶魅力企業(yè)(U)為以pH6.0、0.5%槐豆膠為底物，在55℃水浴中反映10min，每1lmin造成等同于lumolD-甘露糖所須要的酶的量。

式中：Fg-由標(biāo)曲查出來的甘露糖mg數(shù)、n-稀釋倍數(shù)、0.1-酶液mL數(shù)、t-控溫時(shí)間、180-甘露糖相對(duì)分子質(zhì)量。

4、菌種評(píng)定

將挑選獲得的菌種注射于LB液體培養(yǎng)基塑造8～12h，離心式搜集菌體。選用Ezup立柱式病菌基因DNA抽提檢測(cè)試劑盒(生工生物工程項(xiàng)目股權(quán)有限責(zé)任公司)獲取病菌總基因DNA。選用16SrDNA增加通用引物：

7F：CAGAGTTTGATCCTGGCTAGGAGGTGATCCAGCCGCA、27F：AGTTTGATCMTGGCTCAGGGTTACCTTGTTACGACTT，增加該菌種的16SrDNA。PCR反映管理體系：基因DNA(20～50ng/uL)0.5μL、10xBuffer(withMg2 )2.5L、dNTP(2.5mmol)1μL、酶0.2μL、F(10umol)0.5μL、R(10umol)0.5μL、加雙純凈水至25μL。PCR循環(huán)系統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn)：預(yù)轉(zhuǎn)性：94C4min，轉(zhuǎn)性：94℃45sec，淬火：55℃45sec，拓寬(30cycle)：72℃1min，修補(bǔ)拓寬：72℃10min，停止反映：4℃。將得到的PCR物質(zhì)經(jīng)1%瓊脂糖電泳電泳原理，選用SanPrep立柱式DNA膠回收利用檢測(cè)試劑盒(生工生物工程項(xiàng)目股權(quán)有限責(zé)任公司)回收利用PCR物質(zhì)。將PCR獲得的16SrDNA送往生工生物工程項(xiàng)目(上海市)股權(quán)有限責(zé)任公司開展轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，獲得轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果后進(jìn)到NCBI網(wǎng)址，BLAST數(shù)據(jù)分析GenBank中原有的病菌16SrDNA，并應(yīng)用MEGAX搭建該菌種的系統(tǒng)發(fā)育樹開展開放閱讀框剖析。

5、響應(yīng)面BOX-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單要素試驗(yàn)效果的根基上，對(duì)發(fā)醇培養(yǎng)液構(gòu)成開展響應(yīng)面提升。選擇變量要素為A-魔芋精粉、B-酵母菌浸粉、C-Mn22 ，響應(yīng)值(R1)為酶活。應(yīng)用手機(jī)軟件Design-Expert10.0.7對(duì)以上要素開展回應(yīng)斜面多元回歸分析，對(duì)發(fā)醇培養(yǎng)液的構(gòu)成開展提升。BOX-Behnken實(shí)驗(yàn)要素水準(zhǔn)表如表1：

二、結(jié)果與剖析

1、菌種的剝離與挑選

將聚集細(xì)胞培養(yǎng)液的封閉液施膠于挑選培養(yǎng)液，產(chǎn)甘露聚糖酶的菌種會(huì)在培養(yǎng)液上生長發(fā)育，為此來挑選菌種。選擇漲勢(shì)較好且菌體直徑大的10株單菌體進(jìn)到復(fù)篩，并定名為NSG-1、NSG-2、……、NSG-10。

將挑選獲得的10株菌開展搖瓶發(fā)醇，用DNS測(cè)定方法粗酶液酶魅力。

NSG-6在經(jīng)耐堿性試驗(yàn)后酶魅力為1.78U/mL相對(duì)性最大，其一切正常酶魅力為2.05U/mL，故將其做為供試菌種。

加雙純凈水至25μL。PCR循環(huán)系統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn)：預(yù)轉(zhuǎn)性：94℃4min，轉(zhuǎn)性：94℃45sec，淬火：55℃45sec，拓寬(30cycle)：72℃1min，修補(bǔ)拓寬：72℃10min，停止反映：4℃。將得到的PCR物質(zhì)經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，選用SanPrep立柱式DNA膠回收利用檢測(cè)試劑盒(生工生物工程項(xiàng)目股權(quán)有限責(zé)任公司)回收利用PCR物質(zhì)。將PCR獲得的16SrDNA送往生工生物工程項(xiàng)目(上海市)股權(quán)有限責(zé)任公司開展轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，獲得轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果后進(jìn)到NCBI網(wǎng)址，BLAST數(shù)據(jù)分析GenBank中原有的病菌16SrDNA，并應(yīng)用MEGAX搭建該菌種的系統(tǒng)發(fā)育樹開展開放閱讀框剖析。