目的：為豬場(chǎng)實(shí)驗(yàn)室提供科學(xué)的非洲豬瘟病毒核酸診斷試劑盒選擇方案。方法：選擇4種非洲豬瘟核酸檢測(cè)試劑盒，通過對(duì)比梯度稀釋后標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的線性擴(kuò)增、對(duì)低含量時(shí)（20copies/μL）的敏感性、對(duì)以純水為樣本時(shí)假陽性檢出率。結(jié)果：線性擴(kuò)增試驗(yàn)中，A試劑盒對(duì)20copies/μL濃度的標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)率為100%(3/3)，其他試劑盒對(duì)該濃度下的標(biāo)準(zhǔn)品，均未達(dá)到100%；低含量敏感性試驗(yàn)中，A試劑盒陽性檢出率為91.67%(44/48)，其他廠家試劑盒的檢出率分別為85.42%(41/48)、79.17%(38/48)、58.33%(28/48)；假陽性試驗(yàn)中，A和B未出現(xiàn)陽性反應(yīng)，而C、D試劑盒分別出現(xiàn)2、1個(gè)非特異性反應(yīng)。結(jié)論：經(jīng)過性能比較，A試劑盒更符合豬場(chǎng)實(shí)驗(yàn)室對(duì)于高敏感性和低假陽性的要求。

非洲豬瘟病毒（AfricanSwinefevervirus，ASFV）是一類古老的病毒，早在1921年在非洲肯尼亞首次發(fā)現(xiàn)，至今有約100年的歷史。非洲豬瘟（Africanswinefever，ASF）即是由非洲豬瘟病毒引起的家豬、野豬的一種急性、熱性、高度接觸性動(dòng)物傳染病，所有品種和年齡的豬均可感染，發(fā)病率和死亡率高，可達(dá)100%。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織將其列為法定報(bào)告動(dòng)物疫病，中國也將其列為一類動(dòng)物疫病。ASF最早于1921年在非洲肯尼亞被發(fā)現(xiàn)，1957年傳入歐洲，1971年傳入加勒比海地區(qū)和南美洲，2007年傳入高加索地區(qū)，現(xiàn)仍在非洲、南撒丁島和高加索地區(qū)流行，給世界各國的養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大經(jīng)濟(jì)損失。2018年8月3日，中國確診首例非洲豬瘟疫情，之后不斷蔓延，2020年4月19日，海南報(bào)道非洲豬瘟疫情后，我國內(nèi)地31個(gè)省份，已全部發(fā)現(xiàn)非洲豬瘟疫情。

目前尚無有效的疫苗對(duì)非洲豬瘟進(jìn)行防控，各地養(yǎng)殖場(chǎng)需依賴生物安全措施，并組建快速診斷實(shí)驗(yàn)室，使用高精準(zhǔn)的檢測(cè)方法，對(duì)進(jìn)出入豬場(chǎng)物質(zhì)進(jìn)行監(jiān)測(cè)。該研究旨在通過比對(duì)不同廠家的非洲豬瘟核酸診斷試劑盒的主要性能，為豬場(chǎng)實(shí)驗(yàn)室提供科學(xué)的試劑盒選擇方案，幫助豬場(chǎng)合理選擇試劑盒，構(gòu)筑穩(wěn)固的生物安全檢測(cè)防線，阻擊非洲豬瘟的入侵。

1材料與方法

1.1試劑盒與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)

4種商品化的非洲豬瘟病毒實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)試劑盒，A廠家試劑盒（非預(yù)混型）批次342020005，B廠家試劑盒（非預(yù)混型）批次202006，C廠家試劑盒（預(yù)混型）批次20191118，D廠家試劑盒（預(yù)混型）批次20200301;B646L基因標(biāo)準(zhǔn)品GBW(E)091034（批號(hào)：2020001）購自中國牧工商集團(tuán)有限公司。

1.2試驗(yàn)儀器

實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀SLAN-48P購自上海宏石醫(yī)療科技有限公司。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1線性擴(kuò)增試驗(yàn)

將B646L基因標(biāo)準(zhǔn)品稀釋至1000copies/μL、100copies/μL、20copies/μL、4copies/μL、0.8copies/μL，共5個(gè)稀釋度，使用4種試劑盒，按照其說明書配置PCR體系，進(jìn)行熒光PCR檢測(cè)，每個(gè)稀釋度重復(fù)3次，同時(shí)設(shè)置陰陽性對(duì)照。分析各試劑盒對(duì)不同梯度核酸檢測(cè)Ct值，比較不同試劑盒對(duì)各稀釋度的檢出率和變異系數(shù)。

1.3.2敏感性試驗(yàn)

將B646L基因標(biāo)準(zhǔn)品稀釋至20copies/μL，使用4種試劑盒對(duì)稀釋后的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行熒光PCR擴(kuò)增，每種試劑盒重復(fù)檢測(cè)48個(gè)孔，統(tǒng)計(jì)該拷貝數(shù)下不同試劑盒的檢出率。

1.3.3假陽性檢測(cè)試驗(yàn)

使用純化水做無模板陰性對(duì)照，每種試劑盒配置46個(gè)陰性反應(yīng)，設(shè)置陰陽性對(duì)照。統(tǒng)計(jì)不同試劑盒出現(xiàn)假陽性的次數(shù)，假陽性概率最低者為佳。

2結(jié)果與分析

2.1線性擴(kuò)增結(jié)果

使用4種試劑盒對(duì)稀釋后的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，4種試劑盒在1000copies/μL、100copies/μL兩種拷貝數(shù)的檢出率均為100%，在拷貝數(shù)稀釋至20copies/μL時(shí)出現(xiàn)檢出率的差異：A試劑盒的檢出率為100%(3/3)，B試劑：檢出率為33.33%(1/3)，C試劑盒的檢出率為33.33%(1/3)，D試劑盒的檢出率為66.67%(2/3）。A試劑盒在20copies/μL的檢出率高于其他試劑盒，具體結(jié)果見表1與表2。

2.2敏感性試驗(yàn)結(jié)果

使用4種試劑盒對(duì)稀釋至20copies/μL的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示A試劑盒的檢出率最高為91.67%(44/48)，B試劑盒的檢出率次之為85.42%(41/48)，C試劑盒的檢出率為79.17%(38/48)，D試劑盒的檢出率為58.33%(28/48），具體結(jié)果見圖1與表3。

2.3假陽性檢測(cè)試驗(yàn)結(jié)果

使用純水做無模板陰性，每種試劑盒配置46個(gè)陰性反應(yīng)，設(shè)置陰陽性對(duì)照，統(tǒng)計(jì)不同試劑盒出現(xiàn)假陽性（有Ct值且曲線不典型）的次數(shù)，A試劑盒未檢到陽性，B試劑盒未檢測(cè)到陽性，C試劑盒檢測(cè)2個(gè)非特異性陽性反應(yīng)，D試劑盒檢測(cè)到1個(gè)非特異性陽性反應(yīng)，具體結(jié)果見圖2與表4。

3討論

該研究比較了4個(gè)廠家生產(chǎn)的非洲豬瘟核酸診斷試劑盒對(duì)B646L基因標(biāo)準(zhǔn)品的檢測(cè)結(jié)果，結(jié)果顯示：線性擴(kuò)增試驗(yàn)中，A試劑盒對(duì)20copies/μL濃度的標(biāo)準(zhǔn)品檢出率為100%(3/3），其他試劑盒對(duì)該濃度下的標(biāo)準(zhǔn)品的檢出率均未達(dá)到100%；敏感性試驗(yàn)中，A試劑盒對(duì)稀釋至20copies/μL的48個(gè)重復(fù)，檢出率為91.67%(44/48），其他試劑盒的檢出率分別為85.42%(41/48）、79.17%(38/48）、58.33%(28/48）；假陽性試驗(yàn)中，A試劑盒和B試劑盒，未出現(xiàn)陽性反應(yīng)，C、D試劑盒分別出現(xiàn)2、1個(gè)非特異陽性反應(yīng)。綜合3個(gè)試驗(yàn)的結(jié)果，A試劑盒在不同稀釋濃度下的檢出率、低濃度（20copies/μL）的檢出率、假陽性出現(xiàn)頻次上領(lǐng)先其他試劑盒，更符合豬場(chǎng)實(shí)驗(yàn)室對(duì)于高敏感性和低假陽性的需求，可以應(yīng)用于豬場(chǎng)實(shí)驗(yàn)室非洲豬瘟病毒的核酸診斷。

非洲豬瘟病毒對(duì)腐敗、溫度、干燥及消毒劑都具有較強(qiáng)的抵抗力。在適宜的蛋白質(zhì)環(huán)境下，非洲豬瘟病毒可在較大的溫度范圍和pH范圍內(nèi)存活，在血液、尿、糞中非常穩(wěn)定，能長時(shí)間存活于經(jīng)加工過的豬肉制品中。由于ASFV在環(huán)境中穩(wěn)定、存活時(shí)間長，生物安全是防控該病毒的唯一方案，進(jìn)入豬場(chǎng)的物質(zhì)和人員必須進(jìn)行執(zhí)行嚴(yán)格的生物安全洗消，并進(jìn)行核酸檢測(cè)。選擇一款敏感性高、假陽性少的試劑盒，能大大提升豬場(chǎng)生物安全牢固程度。

試劑盒的敏感性較低，可能與引物和探針序列、試劑盒生產(chǎn)工藝相關(guān)。在臨床檢測(cè)過程中，檢出率偏低除與試劑盒敏感性有關(guān)外，還可能與樣本復(fù)雜程度、樣本采集運(yùn)輸、樣本核酸提取等各種因素相關(guān)；實(shí)驗(yàn)室出現(xiàn)假陽性，可能與試劑盒不穩(wěn)定、實(shí)驗(yàn)室污染、設(shè)備的閾值線設(shè)定等方面相關(guān)，豬場(chǎng)實(shí)驗(yàn)室需要綜合各方面的因素進(jìn)行判斷，該研究中C、D試劑盒為預(yù)混裝，產(chǎn)生的假陽性可能與試劑預(yù)混后，發(fā)生非特異性反應(yīng)有關(guān)。

該研究僅對(duì)4個(gè)廠家試劑某一批號(hào)的檢測(cè)能力做了簡要比較分析，樣本量有限，并不能代表各試劑的整體檢測(cè)性能，僅作為一種試劑盒比對(duì)方案，供豬場(chǎng)實(shí)驗(yàn)室參考，實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)能力除與試劑盒相關(guān)性能相關(guān)外，還需要實(shí)驗(yàn)室的操作人員嚴(yán)格遵循標(biāo)準(zhǔn)操作流程，執(zhí)行嚴(yán)格的質(zhì)量控制，避免因操作原因引起的假陰性和假陽性結(jié)果。