γ-氨基丁酸(GABA)是一種四碳非蛋白質(zhì)氨基酸，是由谷氨酸脫羧酶不可逆、專一地將L-谷氨酸的α-羧基脫去-分子CO₂得到，是高度溶于水的兩性離子，pK值為4.03和10.56，因此表現(xiàn)出與該類氨基酸類似的生理活性，即作為一種抑制性神經(jīng)遞質(zhì)存在于哺乳動物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中。目前廣泛應用于工業(yè)、動物飼料、醫(yī)藥和食品行業(yè)。

大量研究表明，GABA有促進睡眠、增強記憶力、抗焦慮、預防和治療癲癇、延緩腦衰老、舒緩血管、調(diào)節(jié)激素分泌、提高受精率、解除氨毒、增強肝功能等作用。

目前制備GABA的方法主要有植物富集法、化學合成法、微生物發(fā)酵法、酶催化法。植物富集法生產(chǎn)GABA雖然安全環(huán)保，但GABA濃度低，尚無法用作藥物、食品添加劑；化學合成法生產(chǎn)GABA安全性較差、有化學殘留，也不易達到醫(yī)藥及食品行業(yè)的標準：微生物發(fā)酵法得到的GABA是一個多相復雜體系，濃度低，下游產(chǎn)物分離成本高，是生產(chǎn)高純度、高濃度GABA的一個瓶頸問題。所以，目前制備GABA多采用酶催化法，主要是利用微生物細胞內(nèi)分離得到的谷氨酸脫羧酶或能夠生產(chǎn)谷氨酸脫羧酶的微生物細胞專一、不可逆地脫去L-谷氨酸的α-羧基，從而得到高濃度、高純度的GABA。此方法的優(yōu)點是反應條件溫和、不需要昂貴的原料、能耗低，并且微生物來源的谷氨酸脫羧酶和能夠生產(chǎn)谷氨酸脫羧酶的微生物細胞可通過簡單的細胞培養(yǎng)大量獲取。

目前大多研究以大腸桿菌為宿主表達GAD，催化生產(chǎn)GABA。在重組菌發(fā)酵過程中添加一定濃度的輔酶磷酸吡哆醛(PLP)能夠促進GAD的折疊，從而提高GAD酶活力。除此之外，酶催化法即利用GAD將谷氨酸脫去一分子CO₂制備GABA過程中，在酶轉(zhuǎn)化體系中添加一定量的PLP可以促進酶液或全細胞的轉(zhuǎn)化舊。有研究者報道了在大腸桿菌發(fā)酵過程中直接添加0.02mmol/LPLP后，GABA產(chǎn)量是對照的2.0～2.5倍。但是PLP價格昂貴，在發(fā)酵過程和酶轉(zhuǎn)化體系中直接添加無疑大大增加生產(chǎn)成本。由于大腸桿菌自身具備吡哆醛激酶(PdxK)基因和磷酸吡哆醇氧化酶(PdxH)基因，從而形成PLP補救途徑(見圖1)。輔酶前體吡哆醇(PN)、吡哆胺(PM)和吡哆醛(PL)上57羥甲基通過PdxK使其磷酸化，生成對應的輔酶中問體磷酸吡哆醇(PNP)和磷酸吡哆胺(PMP)以及輔酶磷酸吡哆醛(PLP)，PdxH進一步催化PNP或PMP的氧化反應，生成輔酶PLP，輔酶PLP的增加可促進GAD的折疊，提高GAD酶活力。黃燕等研究了在大腸桿菌發(fā)酵過程中添加PN后，酶活是對照組(不添加PN)的1.8倍。

但是大腸桿菌為非食品安全菌株，在發(fā)酵過程中易產(chǎn)生內(nèi)毒素，并且需要添加價格昂貴且有毒害作用的IPTG作為誘導劑誘導產(chǎn)酶，其生產(chǎn)得到的GAD安全性不高，距離滿足食品和醫(yī)藥領域的要求還有一定差距?？莶菅挎邨U菌是通過美國食品和藥物管理局GARS認證的安全菌株，廣泛應用在食品、醫(yī)藥生產(chǎn)中。然而在枯草芽孢桿菌中缺少PdxH，所以無法利用添加輔酶前體PN的方式，通過PLP補救途徑將PN轉(zhuǎn)化為PLP，從而提高GAD酶活力。目前，大量的研究集中在以枯草芽孢桿菌為宿主生產(chǎn)GAD，在酶轉(zhuǎn)化過程中通過直接添加輔酶PLP提高轉(zhuǎn)化效率，如丁偉等運用安全宿主枯草芽孢桿菌生產(chǎn)GABA，在其轉(zhuǎn)化過程巾直接添加PLP，全細胞催化GABA產(chǎn)量為239.91g/L，轉(zhuǎn)化率54.48％。由于PLP價格昂貴，導致生產(chǎn)成本較高，無法適應工業(yè)化生產(chǎn)需求。關于在枯草芽孢桿菌為宿主生產(chǎn)GAD發(fā)酵過程中，添加價格低廉的輔酶前體以提高GAD酶活力的研究未見報道。因此作者以枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)為宿主，通過基因工程將大腸桿菌來源的谷氨酸脫羧酶基因(gadB)在B.sMbtilis中異源表達，添加相對廉價的輔酶前體PL，通過PdxK介導的PLP補救途徑將其轉(zhuǎn)化生成PLP(見圖2)，從而提高酶活和產(chǎn)量，降低生產(chǎn)成本。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒

質(zhì)粒EcoliJMl09/pET-24a(+)-gadB為作者所在實驗室前期構(gòu)建，菌株B.5Mbtilis和表達載體pHY300PLK(含啟動子P_HfpaH和P_armyQ，不含信號肽)由作者所在實驗室保存。

1.1.2 培養(yǎng)基

LB液體培養(yǎng)基(g/L)：分別稱取氯化鈉10g、酵母粉5g、蛋白胨10g，溶于1L去離子水中，并通過添加2mol/LNaOH或HCl調(diào)節(jié)pH至7.0。

LB固體瓊脂培養(yǎng)基：LB液體培養(yǎng)基中添加質(zhì)量濃度為20g/L的瓊脂粉。

高滲液體培養(yǎng)基：LB液體培養(yǎng)基巾添加0.5mol/L山梨醇。

電轉(zhuǎn)培養(yǎng)基：LB液體培養(yǎng)基中分別添加0.5mol/L山梨醇和甘露醇，質(zhì)量濃度為100g/L的葡萄糖。

RM培養(yǎng)基：LB液體培養(yǎng)基中添加0.5mol/L山梨醇和0.38mol/L甘露醇。

TB培養(yǎng)基(g/L)：分別稱取酵母粉24g、蛋白胨12g、甘油5g、三水磷酸氫二鉀16.43g、磷酸二氫鉀2.31g，溶于1L去離子水中，并添加2mol/LNaOH或HCl調(diào)節(jié)pH至7.0。

1.1.3 試劑

pH至7.0。1.1.3試劑QuickcutHindⅢ限制性內(nèi)切酶：購自TaKaRa生物醫(yī)藥技術有限公司；2xphantaMaxMasterMix、ExnaseⅡ無縫連接試劑盒：購自諾唯贊(南京)生物科技有限公司；DL-10000DNAMarker、氨芐青霉素、四環(huán)素：購白寶生物有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA同收試劑盒：購白天根生化科技(北京)有限公司

UnstainedProteinMWMarker標準蛋白品、蛋白膠制備試劑盒：購自碧云天生物技術有限公司：分子級的蛋白胨和酵母粉：購自英國Oxiod公司：其他常規(guī)試劑：購自國藥化學試劑有限公司。

1.1.4 主要儀器

PCR儀：購自美國Bio-Rad公司：722型紫外可見分光光度計：購白上海儀電分析儀器有限公司：冷凍式離心機：購自Beckmancoulter公司：KQ-250E型超聲波細胞粉碎機：購自寧波新芝生物科技股份有限公司；pH計：購自瑞士Mettler-Toledo公司：高效液相色譜儀：購自安捷倫科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 引物設計

以質(zhì)粒pET-24a(+)-gadB為模板，根據(jù)無縫克隆同源臂設計原則分別設計正、反向引物：正向弓I物(F1)：57-GGAGTGTCAAGAATGGACCAGAAGCTGTTAACGGA-3'：反向引物(R1)：5'-‘ITTATTACCAAGCTTTCAGGTGTGTTTAAAGCTGTTC-3’。

以質(zhì)粒載體pHY300PLK為模板，根據(jù)無縫克隆同源臂設計原則分別設計正、反向引物：
正向引物(F2)：5'-TCAAATAAGGAGTGTCAAGAATG-3’：反向引物(R2)：5’-GGTGTTTTTTTACCAAGCTT-3’。
將設計好的引物送至蘇州金唯智生物科技有限公司合成。

1.2.2 目的基因和表達載體的獲取

以實驗室保存的質(zhì)粒pET-24a(+)-gadB為模板，F(xiàn)1/R1為正反向引物擴增gadB目的基因；PCR反應體系(50μL)：5×PSBuffer10μL、ddH₂034μL、dNTP4μL、模板DNA0.5μL，正、反向引物各0.5μL，PrimerSTARPolymerase0.5μL。

PCR程序：94℃預變性5min，98℃變性10S，55℃退火5S。72℃延伸2min，變性至延伸過程進行29個循環(huán)：72℃延伸10min；4℃保存。

以質(zhì)粒載體pHY300PLK為模板，F(xiàn)2/R2為正反向引物擴增表達載體；PCR反應體系(50μL)：5×PSBuffer10μL、ddH₂O34μL、dNTP4μL、模板DNA0.5μL,正、反向引物各0.5μL，PrimerSTARPolymerase0.5μL。

PCR程序：94℃預變性5min，98℃變性10s，55℃退火5S，72℃延伸6min，變性至延伸過程進行29個循環(huán)：72℃延伸10min；4℃保存。

目的基因和表達載體PCR條帶通過瓊脂糖核酸電泳進行驗證。

1.2.3 目的基因和表達載體的連接與鑒定

1.2.2已驗證正確的PCR產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠同收試劑盒進行回收。回收后的PCR產(chǎn)物用ExnaseⅡ連接酶連接，其連接體系如下：ddH₂O5.3μL、5×CEBuffer2μL、ExnaseⅡ1μL、表達載體1.16μL、目的基因0.54μL，置于PCR儀37℃反應30min完成連接。

采用大腸桿菌JMl09熱擊轉(zhuǎn)化法后，將轉(zhuǎn)化細胞液涂布至含100μg/mL氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上，在37℃恒溫培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)10～12h，挑取單菌落至含100μg/mL氨芐青霉素的10mLLB液體培養(yǎng)基中，置于恒溫搖床37℃、200r/min培養(yǎng)8～10h后收集菌體，并提取質(zhì)粒以便驗證和進行后續(xù)實驗。將提取的質(zhì)粒進行HindⅢ酶切驗證正確后送往蘇州金唯智生物科技有限公司測序。將測序正確的質(zhì)粒通過電擊轉(zhuǎn)化法導入表達宿主B.Subtilis中，將轉(zhuǎn)化細胞液涂布至含20μg/mL四環(huán)素的LB同體培養(yǎng)基上，在37℃恒溫培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)10～12h，挑取單菌落至含20μg/mL四環(huán)素的10mLLB液體培養(yǎng)基中，置于恒溫搖床37℃、200r/min培養(yǎng)8～10h后收集菌體，并提取質(zhì)粒進行酶切驗證。