1.2.4 搖瓶發(fā)酵生產(chǎn)CAD及蛋白質(zhì)檢測

將-80℃保存的重組菌B.subtilis/pHY300PLK-gadB以體積分數(shù)0.2％接種至含20μg/mL四環(huán)素的LB液體培養(yǎng)基中,恒溫搖床37℃、200r/min擴大培養(yǎng)8～10h，再以體積分數(shù)5％轉(zhuǎn)接至含20μg/mL四環(huán)素的TB發(fā)酵培養(yǎng)基中，恒溫搖床37℃、200r/min培養(yǎng)2～3h后分別加入一定濃度的PLP、PL、PN，于恒溫搖床33℃、200r/min進行重組蛋白質(zhì)的表達。發(fā)酵過程中在不同時間取樣，測0D₆₀₀。12000r/min離心1min得到菌體和發(fā)酵上清液。將菌體用1mL、50mmol/L、pH5.0的Na₂HP0₄-檸檬酸緩沖液重懸，加入0.6mg/mL溶菌酶，在37℃反應(yīng)30min后置于冰水中超聲破碎，12000r/min離心5min得到破壁上清液和破壁沉淀，使用SDS-PAGE檢測其蛋白質(zhì)。

1.2.5 重組CAD酶活測定底

物溶液配制：0.1mol/L-水谷氨酸鈉和0.15mmol/LPLP溶于50mmol/L、pH4.5的Na₂HPO₄-檸檬酸緩沖液中，置于4℃避光保存。

反應(yīng)體系：將裝有360uL底物溶液的1.5mLEP管于37℃水浴鍋預(yù)熱10min后，加入40uLGAD粗酶液，在37℃下反應(yīng)4min后，加入600uL、0.2mol/L、pH10的硼酸緩沖液終止反應(yīng)，置于沸水中滅活10min。

GABA生成量測定：采用HPLC-OPA氨基酸柱前衍生法檢測GABA生成量。

酶活定義：在反應(yīng)液中，1min催化底物轉(zhuǎn)化生成1umolGABA所需的酶量為一個活力單位(U)。

本文中重組GAD均指重組菌所產(chǎn)的GAD。

1.2.6 重組菌全細胞制備GABA工藝流程

1) GABA的制備

水配制質(zhì)量濃度為127g/L的一水谷氨酸鈉底物(折算成100g/L谷氨酸，以下均以折算后的谷氨酸質(zhì)量濃度進行闡述)。在150mL三角錐形瓶中加入20mL底物，加入一定量的濕菌體(在55℃水浴鍋預(yù)處理50min，改善細胞膜的通透性)，反應(yīng)過程中，每隔2h用0.6mol/L的H₂SO₄和NaOH調(diào)節(jié)pH，使其始終與初始pH一致。在一定溫度、pH下，150r/min水浴搖床中反應(yīng)一段時間，終止反應(yīng)后進行煮沸處理，12000r/min離心5min得上清液，適當(dāng)稀釋并過0.22μm有機濾膜后用HPLC-OPA柱前衍生法進行檢測。

2) GABA生成量的測定

將過濾好的樣品通過HPLC檢測GABA生成量。HPLC色譜條件如下：Agilent1200HPLC色譜儀、Agilent自動進樣器、GLInertsilODS-3液相柱、Agilent紫外檢測器。流動相A：準確量取995mL純凈水，加入4.52g無水乙酸鈉，攪拌使其充分溶解，再加入5mL四氫呋喃和0.2mL三乙胺，之后用冰乙酸調(diào)節(jié)pH至7.20±0.05，充分混合后用0.22μm無機纖維素濾膜過濾備用：流動相B：準確量取200mL純凈水，加入4.52g無水乙酸鈉，攪拌使其充分溶解，用冰乙酸調(diào)節(jié)pH至7.20±0.05后，再依次加入400mL色譜純的乙腈和甲醇，用冰乙酸調(diào)節(jié)pH至7.20+0.05，混合后用0.22μm有機尼龍濾膜過濾備用。梯度洗脫，流量為0.8mL/min，柱溫為40℃。根據(jù)吸收峰面積和GABA標準品峰面積計算GABA生成量，計算公式如下：

式中：Y為GABA轉(zhuǎn)化率，％；4為谷氨酸轉(zhuǎn)化生成GABA的實際質(zhì)量濃度，g/L；T為谷氨酸轉(zhuǎn)化生成GABA的理論質(zhì)量濃度，g/L。

2 結(jié)果與討論

2.1 產(chǎn)谷氨酸脫羧酶重組菌的構(gòu)建

以實驗室保存的質(zhì)粒pET-24a(+)-gadB為模板，擴增gadB目的片段，并以質(zhì)粒載體pHY300PLK為模板，擴增表達載體片段。擴增得到的產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳檢測，目的基因片段gadB和質(zhì)粒表達載體pHY300PLK長度約為1428bp和5731bp，與理論堿基大小一致。驗證正確后通過ExnaseⅡ連接酶將兩個基因片段連接再轉(zhuǎn)入E.coliJMl09感受態(tài)細胞，涂布到LB固體培養(yǎng)基(含氨芐青霉素抗性)后挑取單菌落至LB液體培養(yǎng)基(含氨芐青霉素抗性)中過夜培養(yǎng)。提取質(zhì)粒，酶切驗證和測序成功后，將重組質(zhì)粒用電擊轉(zhuǎn)化法導(dǎo)入表達宿主B.subtilis并涂布到LB固體培養(yǎng)基(含四環(huán)素抗性)，之后挑取單菌落至LB液體培養(yǎng)基(含四環(huán)素抗性)中培養(yǎng)8～10h，提取質(zhì)粒后進行酶切驗證分析。結(jié)果見圖3，分別在5130bp和2100bp處有明顯的條帶，說明重組表達質(zhì)粒pHY300PLK-gadB在B.subtilis中構(gòu)建成功。

2.2 分別添加輔酶及輔酶前體對重組菌搖瓶發(fā)酵的影響

2.2.1 添加不同種類輔酶及輔酶前體對重組菌產(chǎn)酶情況的影響

種類輔酶及輔酶前體對重組菌產(chǎn)酶情況的影響重組菌按照1.2.4進行搖瓶發(fā)酵產(chǎn)酶，搖瓶發(fā)酵溫度33℃，在重組菌發(fā)酵過程中分別添加輔酶PLP(簡稱GAD-PLP)、輔酶前體PL(簡稱GAD-PL)和PN(簡稱GAD-PN)至終濃度為0.5mmol/L。發(fā)酵結(jié)束后12000r/min離心1min獲得菌體，用超聲波細胞粉碎機進行細胞破碎，12000r/min離心5min得到GAD粗酶液。結(jié)果見圖4，誘導(dǎo)48h后，酶活分別達到25.40、28.14U/mL和15.55U/mL，是對照GAD-0酶活(16.34U/mL)的1.55、1.72和0.95倍。由此可知，添加0.5mmol/LPN時，酶活相較于對照并無明顯區(qū)別，這是因為枯草芽孢桿菌中缺少PdxH氧化酶，無法通過PLP補救途徑將PN轉(zhuǎn)化為PLP，從而提高GAD酶活力。其次隨著誘導(dǎo)培養(yǎng)時間的延長，細胞內(nèi)合成的少量PLP被自身吸收并消耗而無法滿足GAD表達水平提高的需要。然而向培養(yǎng)基巾添加適量的PLP或PL可以直接或問接通過PLP補救途徑合成PLP，從而提供能夠維持GAD穩(wěn)定的輔酶PLP，促進GAD的折疊，提高酶活。鑒于PLP成本高于PL，所以在發(fā)酵過程中選擇添加PL進行后續(xù)實驗。

2.2.2 不同吡哆醛濃度對重組菌產(chǎn)酶情況的影響

重組菌按照1.2.4進行搖瓶發(fā)酵，在過程中添加不同濃度的PL(0.01、0.03、0.05、0.07、0.1、0.2、0.3mmol/L)發(fā)酵培養(yǎng)48h后，12000r/min離心1min獲得菌體，超聲波細胞破碎機進行細胞破碎，12000r/min離心5min得到GAD粗酶液，結(jié)果見圖5。隨著PL濃度的增加，GAD酶活也隨之提高，當(dāng)PL濃度為0.1mmol/L時，GAD酶活達到最高為28.28U/mL。繼續(xù)增加PL的濃度，酶活并未發(fā)生顯著變化，故可知PL的最適添加濃度為0.1mmol/L。圖6為發(fā)酵過程中添加不同濃度PL后的重組GAD蛋白質(zhì)電泳圖，從圖中可見在相對分子質(zhì)量53000的條帶附近有一條清晰的蛋白質(zhì)電泳條帶，符合GAD理論蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量大小。

2.2.3 添加吡哆醛前后重組菌發(fā)酵過程比較

重組菌按照1.2.4進行搖瓶發(fā)酵，在過程中添加0.1mmol/LPL，探究其在不同發(fā)酵時間(0、12、24、36、48、60h)對重組菌生長(見圖7)和產(chǎn)GAD情況(見圖8)的影響。與GAD-0相比，在發(fā)酵時問36h左右，PL對菌體的生長有一定的促進作州，是因為存蛋白質(zhì)表達過程中，通過PLP補救途徑，PdxK激酶將PL磷酸化形成PLP，促進GAD的折疊，一定程度上有利于菌體生長。隨著發(fā)酵時問的延長，南于PLP穩(wěn)定性差而失去作用,導(dǎo)致菌體的生長有所下降。由圖8可知，與GAD-0相比，GAD-PL酶活最高達到28.28U/mL，添加適量的PL可以提供給GAD未知濃度的PLP，從而提高GAD酶活。