木耳做為一種寶貴的傳統(tǒng)式服用細(xì)菌，不但能為身體給予碳水化合物、蛋白、膳食纖維素等營養(yǎng)元素，還有著抗氧化性、抗癌、降血脂和避免心腦血管疾病等各種活力作用。木耳帶有各種營養(yǎng)元素，在其中所含含糖量成份的功能科學(xué)研究相對普遍，尤其是在食品類和保健產(chǎn)品開發(fā)設(shè)計領(lǐng)域具備運用使用價值，如木耳飲品、木耳原漿、油類等。研究發(fā)現(xiàn)，木耳含糖量可以明顯增強人體免疫能力，抑止小白鼠脾網(wǎng)織紅細(xì)胞轉(zhuǎn)換繁衍工作能力，提高其小膠質(zhì)細(xì)胞吞食工作能力和當(dāng)然殺傷力體細(xì)胞活力。腸道微生物是身體的關(guān)鍵新陳代謝“人體器官”，在消化、基礎(chǔ)代謝和免疫反應(yīng)等生命活動中充分發(fā)揮關(guān)鍵功效。伴隨著對腸道微生物與人體健康研究的深層次，發(fā)覺一切正常生理學(xué)情況下身體腸菌處在平衡情況，當(dāng)內(nèi)環(huán)境破壞或遭受外部影響時，會造成 腸胃內(nèi)有益菌混亂，對人體身心健康造成危害。比如，抗生素濫用會毀壞腸道微生物物種均衡，提升炎性病癥風(fēng)險性。益生菌粉根據(jù)代謝一系列抑菌化學(xué)物質(zhì)（有機物、雙氧水和病菌素等）減少腸內(nèi)pH，提升短鏈脂肪酸（Shortchainfattyacid，SCFA）成分來降低病原菌活菌數(shù)。研究發(fā)現(xiàn)，含糖量能夠增進(jìn)腸胃優(yōu)點菌繁衍和調(diào)整腸胃內(nèi)分必物，進(jìn)而促使腸胃內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)和身體身心健康。

雖然木耳具備較高的食用價值和寬廣的應(yīng)用前景，可是其含糖量成份對腸道微生物的控制功效與體制仍不清楚。為了更好地明確木耳含糖量對腸菌轉(zhuǎn)變的調(diào)節(jié)效用以及微生物作用，本科學(xué)研究運用小白鼠實體模型，剖析木耳胞外含糖量對小白鼠腸菌多元性、SCFA成分轉(zhuǎn)變及血清蛋白細(xì)胞因子的危害，為木耳含糖量益生菌粉微生態(tài)制劑和新式營養(yǎng)食品的研發(fā)給予理論基礎(chǔ)。

1原材料與方式

1.1原材料與實驗試劑

木耳菌種（GenBank：KF297975.1，天津市科技學(xué)院生物技術(shù)與生物學(xué)試驗室儲存）。工業(yè)乙醇（剖析級）、葡萄糖水（剖析級）、硫酸（剖析級）、二甲苯（剖析級），天津市北方地區(qū)天醫(yī)化學(xué)藥品廠；三氯甲烷（剖析級）、異戊醇（剖析級）、二氯甲烷（色譜儀級），上海生工生物技術(shù)有限責(zé)任公司；甲酸、己酸、丁酸、異丁酸、戊酸、異戊酸，上海源葉生物技術(shù)有限責(zé)任公司；三聚磷酸鈉抗原修復(fù)液，上海市碧云天生物技術(shù)性有限責(zé)任公司；牛血清蛋白，北京索萊寶高新科技有限責(zé)任公司；GPR43抗原，圣克魯斯生物科技（上海市）有限責(zé)任公司；FIＴC標(biāo)識的瑩光二抗，賽默飛世爾高新科技（我國）有限責(zé)任公司；酶聯(lián)免疫吸咐（ELISA）檢測試劑盒，上海市茁彩生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.2動物實驗

SPF級近交系CD-1雌鼠18只，休重（20±3）g，動物實驗許可證編號：SCXK（京）2016-0006，購于北京市維通利華動物實驗技術(shù)性有限責(zé)任公司。

1.3實驗儀器

AB204-S型電子分析天平，梅特勒-托利多儀器設(shè)備深圳公司；GH-6000型電加熱恒溫培養(yǎng)箱，天津泰斯特儀器設(shè)備有限責(zé)任公司；ALPHA2-4/LD型冷凍式干燥機，法國CHRIS企業(yè)；722型紫外線光度計，上海精科分析儀器公司；7890A氣相色譜，英國安捷倫科技有限責(zé)任公司；BX53正置光學(xué)顯微鏡，日本Olympus企業(yè)。

1.4木耳胞外含糖量獲取

木耳發(fā)醇塑造參考肖紅霞的方式 。發(fā)酵物經(jīng)3000r/min離心式20min棄沉積，上清液立即開展真空蒸發(fā)，濃縮至原容積的1/4，添加工業(yè)乙醇（容積分?jǐn)?shù)30%），4℃留宿。3000r/min離心式20min后，往上清水溶液添加去蛋白質(zhì)實驗試劑（三氯甲烷異戊醇=1∶4）并磁力攪拌10min，3500r/min離心式15min棄沉積，上清液添加工業(yè)乙醇（摩爾分?jǐn)?shù)75%）4℃留宿。4000r/min離心式15min獲得沉淀即是粗多糖，將含糖量沉積自來水復(fù)溶后分析12h，每2h換1次水，接著低溫干燥，獲得木耳胞外含糖量。

1.5含糖量的評定及單糖構(gòu)成剖析

1.5.1含糖量的紅外光譜分析分析

稱量木耳胞外含糖量1mg，添加適量溴化鉀（KBr）粉末狀于研缽中，充足碾磨后碾成全透明片狀，接著用NicoletIS10FＴIR光譜分析儀（ＴhermoScientific，英國）在400～4000cm-1峰位范疇內(nèi)掃描儀，紀(jì)錄IR光譜儀。

1.5.2含糖量的單糖構(gòu)成剖析

本實驗運用高效率液相色譜，融合PMP（1-苯基-3-羥基-5吡唑啉酮）柱前衍化畫法對木耳胞外含糖量試品做好了單糖構(gòu)成剖析。含糖量的溶解和衍化化方式參考王媛媛等科學(xué)研究。高效液相色譜檢驗標(biāo)準(zhǔn)以下：C18色譜柱；流動性相為0.1mol/LpH6.5硫酸銨緩存鹽∶乙腈（V/V）=85∶15；流動速度1mL/min；柱溫40℃；檢驗光波長250nm；進(jìn)樣量20μL。

1.6小動物實驗

1.6.1動物實驗排序及解決

將選購的18只身心健康CD-1雌蟲小白鼠喂養(yǎng)在20～22℃、45%～55%RH的無菌檢測清潔自然環(huán)境中，讓其隨意進(jìn)餐（市面上一般精飼料），適應(yīng)能力飼養(yǎng)7d。將其任意分成2組（每一組9只）即實驗對照實驗（Control），木耳胞外含糖量組（Fermentation-exopolysaccharide，F(xiàn)-P）。將木耳胞外含糖量用鹽水配備，隨后依照1.5g·kg^-1BW^-1開展灌胃解決（每只小白鼠每一次給藥容積為0.2mL），持續(xù)灌胃21d；對照實驗給與等大小的鹽水解決。

1.6.2小白鼠休重及內(nèi)臟器官指數(shù)

實驗期內(nèi)每7d紀(jì)錄1次小白鼠休重，將2組休重均值做變化趨勢。第二十一天，脫位法處決小白鼠后，迅速分離出來肝、脾、心、肺、腎等內(nèi)臟器官，內(nèi)臟器官用吸水海綿吸走后，開展稱重和數(shù)據(jù)收集，最終對內(nèi)臟器官指數(shù)及穩(wěn)定性開展評定。

內(nèi)臟器官指數(shù)=（內(nèi)臟器官品質(zhì)/休重）×100%。

1.6.3小白鼠腸菌剖析評定

灌胃實驗完成后（第二十一天），無菌檢測收集新鮮排泄物0.1g，放進(jìn)殺菌管，將被測試品交派森諾生物技術(shù)有限責(zé)任公司開展有益菌評定剖析。步驟以下：最先獲取試品病菌總DNA，隨后以微生物菌種核糖體RNA總體目標(biāo)編碼序列為靶標(biāo)，設(shè)計方案16SrRNAＶ3-Ｖ4區(qū)的非特異引物設(shè)計，等溫擴增搭建百度文庫。搭建好的百度文庫經(jīng)梯度方向稀釋液，運用IlluminaMiSeq轉(zhuǎn)錄組測序服務(wù)平臺轉(zhuǎn)錄組測序。轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果根據(jù)生物信息學(xué)方式開展亞基因剖析和腸道微生物兩棲綱剖析。

1.6.4小白鼠排泄物中SCFAs成分剖析

低溫干燥排泄物試品，精確稱量50mg試品，添加1.2mL聚磷酸鹽緩沖溶液（pH7.3）攪拌，4℃14000r/min離心式20min，汲取上清液至5mL離心管架中。每200μL上清添加0.1mL的稀釋液后鹽酸（摩爾分?jǐn)?shù)50%），充足攪拌3min，用2mL二氯甲烷（色譜儀級）開展提純，4℃靜放2h，隨后用0.22μm有機濾膜過慮。選用氣象色譜儀（GC）檢驗試樣中短鏈脂肪酸的成分，試品獲取方式參考Zhao等并做一部分改動。GC剖析選用基本HP-FFAP（25m×0.32mm，0.5μm）配備柱，程序流程設(shè)置參考賈益群等在微生物試品油酸獲取與解析的分析結(jié)果，并更改其分離之比20∶1。SCFA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)水溶液的配制及其標(biāo)曲制作參考孟拓等對氣象色譜儀-質(zhì)譜分析聯(lián)用分析法腸道炎小白鼠短鏈脂肪酸新陳代謝科學(xué)研究結(jié)果。

1.6.5小白鼠乙狀結(jié)腸GPR43檢驗

小白鼠灌胃21d后，脫位法處決小白鼠迅速分離出來腸胃交武漢市谷歌生物高新科技有限責(zé)任公司制做石蠟切片。取乙狀結(jié)腸石蠟切片用二甲苯脫臘解決，經(jīng)不一樣濃度梯度酒精開展凝固解決后用三聚磷酸鈉抗原修復(fù)液95℃溫育15min開展抗原修復(fù)，并將其降溫到室內(nèi)溫度，經(jīng)3%BSA室內(nèi)溫度封閉式解決30min完用GPR43抗原4℃孵育12h，以后用FIＴC標(biāo)識的瑩光二抗室內(nèi)溫度遮光孵育1.5h，再用DAPI室內(nèi)溫度遮光孵育30min，執(zhí)行封片并留宿吹干，于暗室標(biāo)準(zhǔn)下開展光學(xué)顯微鏡觀查。

1.6.6小白鼠血清蛋白細(xì)胞因子測量

小白鼠灌胃21d后，根據(jù)摘目光采血，并將血夜儲存在帶有乙二胺四乙酸絡(luò)合劑（EDＴA）的搜集管內(nèi)，4℃儲放3h。待當(dāng)然沉淀后，用無菌檢測槍嘴汲取血清蛋白，運用酶聯(lián)免疫法（ELISA）測量小白鼠血清蛋白中IL-6、IL-10和ＴNF-α的成分。實驗流程參考上海市茁彩生物技術(shù)有限責(zé)任公司ELISA檢測試劑盒實際操作使用說明。

1.7應(yīng)用統(tǒng)計學(xué)剖析

實驗結(jié)果選用Graphpad5.0分析手機軟件數(shù)據(jù)分析，t檢驗剖析每組間顯著性差異，數(shù)據(jù)信息以x-±s表明，當(dāng)P＜0.05時，覺得具備顯著性差異。