以多巴（L-DOPA）為底物，測(cè)量色氨酸酶的活性。先將被測(cè)試品用乙醇融解，配置成濃度值為1Mg/ML的儲(chǔ)備液，再逐個(gè)稀釋液成不一樣含量的試品水溶液。按表2所顯示，先后精確汲取不一樣含量的試品水溶液，pH6.8的0.5MoL/L聚磷酸鹽緩沖液，0.5MMoL/LL-DOPA水溶液和0.15Mg/ML酪氨酸酶水溶液，充足攪拌，在37℃恒溫水浴鍋中孵育反映30MiN，隨后馬上測(cè)量各試管嬰兒中反映水溶液在475NM處的吸光度值。以上實(shí)驗(yàn)均反復(fù)3次。依據(jù)酶反映特異性的界定，在一定的緩聚劑濃度值下，酶反映活力表明為ACTi，在沒有緩聚劑時(shí)酶反映活力表明為ACT0，則受試試品對(duì)酶的相對(duì)性抑制率（I）能夠界定為：
 

式中，ACTi—有緩聚劑時(shí)的酶反映活力；ACT₀—沒有緩聚劑時(shí)的酶反映活力；A₁，A₂，A₃，A₄—1，2，3，11號(hào)反映液的吸光度值。

1.2.7 B16黑素瘤體細(xì)胞體細(xì)胞MTT實(shí)驗(yàn)

稱量50g重絡(luò)酸固態(tài)，以100ML純凈水100℃融解（電爐加熱），迅速添加900ML濃H₂sO₄，攪拌，制冷就可以應(yīng)用。MTT用PBs配置成濃度值5Mg/ML，過0.22μM水相濾紙后存于10ML無菌檢測(cè)離心管架中，于-20℃冷藏儲(chǔ)存。操作步驟：

1）取柚皮苷、NariNgiNDC和熊果素的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)

20Mg，添加DMsO融解配出500MMoL/L的水解液，過0.22μM有機(jī)濾膜后以每管20μL散裝于無菌檢測(cè)的200μL離心管架中，于-20℃冷藏儲(chǔ)藏。

2）不一樣濃度值試品的配置

各自取柚皮苷、NariNgiNDC和熊果素3種化學(xué)物質(zhì)500MMoL/L的水解液各4μL，添加4ML1640基本培養(yǎng)液中，配出500μMoL/L的水溶液，隨后各自稀釋液到250，125，62.5μMoL/L3個(gè)濃度值。

3）96孔細(xì)胞培養(yǎng)板塑造體細(xì)胞

在凈化工作臺(tái)中移取5ML75T細(xì)胞培養(yǎng)瓶停止消化吸收后的體細(xì)胞與細(xì)胞培養(yǎng)液的溶液于離心管架中，800r/MiN離心式4MiN，棄上清液，移取3ML完全培養(yǎng)基于離心管架并攪拌細(xì)胞液，取以上1ML細(xì)胞液，加1ML完全培養(yǎng)基，取80μL于平板電腦電子計(jì)數(shù)器記數(shù)，用完全培養(yǎng)基稀釋液調(diào)節(jié)體細(xì)胞濃度值為8000個(gè)體細(xì)胞/100μL，用12安全通道移液器將細(xì)胞液攪拌，添加96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔添加100μL，搞好標(biāo)識(shí)后將細(xì)胞培養(yǎng)板放進(jìn)CO2恒溫培養(yǎng)箱塑造24h。

4）96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中添加試品

將以上96孔細(xì)胞培養(yǎng)板放進(jìn)CO2恒溫培養(yǎng)箱塑造24h，用廢水機(jī)械泵吸棄細(xì)胞培養(yǎng)液，每孔添加不一樣含量的試品150μL，而且每片96孔板都需要留1到2列只加基本培養(yǎng)液做空白試驗(yàn)，搞好標(biāo)識(shí)后將細(xì)胞培養(yǎng)板放進(jìn)CO2恒溫培養(yǎng)箱塑造24h。

5）B16黑素瘤細(xì)胞的MTT實(shí)驗(yàn)

在超凈臺(tái)中，取PBs配出濃度值5Mg/ML的MTT水溶液，與基本培養(yǎng)液以容積比1∶9的比率配出MTT細(xì)胞培養(yǎng)液。將流程4）里加試品塑造24h后的細(xì)胞培養(yǎng)液用廢水機(jī)械泵吸棄，每孔添加150μLMTT細(xì)胞培養(yǎng)液，搞好標(biāo)識(shí)后將細(xì)胞培養(yǎng)板放進(jìn)CO2恒溫培養(yǎng)箱塑造4h，吸棄MTT細(xì)胞培養(yǎng)液，每孔添加150μLDMsO，于酶標(biāo)儀中震動(dòng)10MiN后測(cè)量光波長(zhǎng)490NM處的OD值值。

體細(xì)胞成活率=（A₀-Ax）/A₀×100%

式中，A₀—不用試品的空缺O(jiān)D值值；Ax—加不一樣濃度值試品功效后的OD值值。

1．2.8 B16黑素瘤體細(xì)胞HoeChsT瑩光上色實(shí)驗(yàn)

實(shí)際操作流程：

1）于凈化工作臺(tái)上，開啟六填料，置殺菌蓋玻片。將體細(xì)胞懸液體加至蓋玻片上，置CO2摩爾分?jǐn)?shù)為5%的恒溫箱中，37℃塑造至體細(xì)胞接觸抑制（約2h），添加2ML細(xì)胞培養(yǎng)液再次塑造約6h。棄培養(yǎng)液，用PBs洗3次，每一次5MiN。

2）用4%多聚甲醛固定不動(dòng)30MiN，PBs洗3次，每一次5MiN。

3）切成片稍脫水后在圈里滴入適當(dāng)HoeChsT染色液到爬片上，室內(nèi)溫度遮光孵育15MiN。

4）PBs浸洗爬片3次，每一次5MiN，從六填料內(nèi)取下爬片，將有體細(xì)胞的一面封到滴加上抗熒光淬滅封片狀的玻璃片上，光學(xué)顯微鏡下觀查并照相。

1.2.9 NariNgiNDC與雙孢蘑菇酪氨酸酶的分子對(duì)接

選用CheMBioDrawULTra14.0繪制化學(xué)物質(zhì)熊果素和NariNgiNDC的構(gòu)造，隨后用CheMBio3DULTra14.0轉(zhuǎn)換為三維構(gòu)造，用MMFF94引力場(chǎng)開展提升。雙孢蘑菇酪氨酸酶的三維構(gòu)造（PDBiD：2Y9X）從RCsB蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)下載。酪氨酸酶和化學(xué)物質(zhì)均應(yīng)用AuToｄoCkTooLs1.5.6轉(zhuǎn)換為PDBQT文件格式。選用AuToｄoCkviNa1.1.2開展分子對(duì)接。酪氨酸酶活力結(jié)構(gòu)域的座標(biāo)設(shè)定為：CeNTer_x=-10.044，CeNTer_y=-28.706，CeNTer_z=-43.443；size_x=15，size_y=15，size_z=15。為了更好地提升測(cè)算的精確度，將主要參數(shù)exhausTiveNess設(shè)定為20。其他參數(shù)均用初始值。最終，選擇打得分最大的構(gòu)像用PyMoL1.7.6開展結(jié)果剖析。

2 結(jié)果與探討

2.1 柚皮苷、NaringinDC、NHDC及原兒茶醛對(duì)ABTS氧自由基的清理實(shí)際效果

以TroLox做為對(duì)比，以其濃度值-吸光度值制作標(biāo)曲y=0.3627x 0.0661（R2=0.9943），科學(xué)研究柚皮苷、NariNgiNDC、NHDC及原兒茶醛4種試品對(duì)ABTs氧自由基消除實(shí)際效果，結(jié)果見圖3。4種試品對(duì)ABTs氧自由基消除實(shí)際效果以TroLox的抗氧化性摩爾質(zhì)量表明，結(jié)果見表3。

由表3得知，4種試品對(duì)ABTs氧自由基均有消除功效。以TroLox做為對(duì)比，4種試品的總抗氧化能力結(jié)果中，柚皮苷的TroLox抗氧化性摩爾質(zhì)量為0.1748MMoL/g，NHDC為2.9109MMoL/g，NariNgiNDC為0.6986MMoL/g，原兒茶醛為39.6103MMoL/g。4種試品對(duì)ABTs氧自由基消除工作能力先后為原兒茶醛＞NHDC＞NariNgiNDC＞柚皮苷。

2.2 柚皮苷、NaringinDC、NHDC及原兒茶醛對(duì)羥氧自由基的清理實(shí)際效果

以TroLox為對(duì)比，以其濃度值-吸光度值制作標(biāo)曲y=4.0588x 0.079（R2=0.9998），科學(xué)研究柚皮苷、NariNgiNDC、NHDC及原兒茶醛4種試品對(duì)羥氧自由基消除實(shí)際效果，結(jié)果見圖4。4種試品對(duì)羥氧自由基消除實(shí)際效果以TroLox的抗氧化性摩爾質(zhì)量表明，結(jié)果見表4。

由表4可看得出，4種試品對(duì)羥氧自由基均有消除功效，實(shí)驗(yàn)中以TroLox做為對(duì)比，獲得柚皮苷消除工作能力的TroLox摩爾質(zhì)量為19.8μMoL/g，NariNgiNDC為31.9μMoL/g，NHDC為44.4μMoL/g，原兒茶醛為365.5μMoL/g。4種試品消除羥氧自由基工作能力先后為原兒茶醛＞NHDC＞NariNgiNDC＞柚皮苷。