乳酸菌乳革蘭陰性桿菌胞外含糖量（EPS）為乳酸菌飲料在成長(zhǎng)新陳代謝全過程中代謝到植物細(xì)胞外的一類核甘酸化學(xué)物質(zhì)。因?yàn)槿樗峋嬃蠈?duì)比別的工業(yè)級(jí)菌安全系數(shù)高，故近些年對(duì)乳酸菌飲料胞外含糖量的分析也慢慢增加。從現(xiàn)有的分析效果看來，生成EPS的乳酸菌飲料中乳酸菌乳革蘭陰性桿菌生成工作能力較強(qiáng)，為80～600mg/L。胞外含糖量做為食用添加劑，可用于多種多樣食品類的增粘劑、增稠劑、破乳劑和膏劑；具備生物活性如免疫力活力、抗癌和抗?jié)€，可使用于藥業(yè)行業(yè)，相對(duì)分子質(zhì)量大概為4.0×10⁴～6.0×10⁶中間。雖然一直以來學(xué)者們對(duì)乳酸菌飲料產(chǎn)EPS的有機(jī)化學(xué)構(gòu)成存有著矛盾，可是較一致覺得：從乳酸菌飲料中剝離獲得的胞外高聚物是由α-和β-聯(lián)接糖反復(fù)模塊所構(gòu)成的含糖量，而且不一樣乳酸菌飲料代謝的EPS種類不一樣。盡管單糖構(gòu)成很有可能有一些類似，多見半乳糖、葡萄糖水和鼠李糖，可是各成份比例不一樣。因?yàn)樘崛∫褐蠩PS的生產(chǎn)量較低、蛋白質(zhì)含量較高，給EPS的獲取產(chǎn)生比較大艱難。因而，發(fā)酵物中獲取EPS加工工藝重要就是蛋白的去除與EPS的沉積，可獲得平穩(wěn)、易使用、殘?jiān)俚暮橇可唐?。本研究?duì)乳酸菌乳革蘭陰性桿菌發(fā)酵物根據(jù)不一樣的標(biāo)準(zhǔn)開展獲取提純EPS，認(rèn)證最好除蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)和含糖量沉積標(biāo)準(zhǔn)，為工業(yè)生產(chǎn)乳酸菌飲料胞外含糖量確立理論基礎(chǔ)。

一、原材料與方式

1、原材料與實(shí)驗(yàn)試劑

乳酸菌乳革蘭陰性桿菌乳亞種LL9（下稱乳革蘭陰性桿菌LL9）：鄭州輕工業(yè)學(xué)校試驗(yàn)室給予，由乳酸菌乳革蘭陰性桿菌乳亞種6242（我國(guó)的工業(yè)技術(shù)微生物菌種菌種保藏管理處（CICC））紫外線誘變，經(jīng)葡萄糖水承受及乳鏈菌肽承受水準(zhǔn)挑選挑出來，較為生物活性最后篩選活力高、乳鏈菌肽生產(chǎn)量高的最優(yōu)控制菌種。

分離純化標(biāo)準(zhǔn)為：發(fā)酵物→加上三氯乙酸至2.5%（w/v）→500r/min拌和5min→4℃沉積除蛋白質(zhì)20min→10000r/s離心式20min除菌體→上清液分析12h→苯酚硫酸法測(cè)量EPS。可獲得乳酸菌飲料胞外含糖量的總產(chǎn)量為262.63mg/L。

6%的甲酸水溶液：精準(zhǔn)稱量6.0g重蒸酚結(jié)晶，用少許的純凈水融解后倒進(jìn)100mL的容量瓶中，滴定劑、充足混勻，倒進(jìn)深棕色玻璃燒杯中預(yù)留。

2、實(shí)驗(yàn)方法

（1）菌種活化

儲(chǔ)存于凡士林管內(nèi)乳革蘭陰性桿菌LL9注射于MRS液體培養(yǎng)基內(nèi)，37℃塑造，傳代2～3次后，上色鏡檢查，選擇優(yōu)質(zhì)菌種，接轉(zhuǎn)斜坡塑造，4℃冷藏室儲(chǔ)藏預(yù)留。

（2）搖瓶發(fā)醇

活性后菌液5%轉(zhuǎn)到搖瓶發(fā)醇，37℃控溫150r/min波動(dòng)塑造24h。

（3）發(fā)酵物解決

取發(fā)醇終點(diǎn)站發(fā)酵物，10000×g下離心式8min除去菌體，取上清液預(yù)留。

（4）苯酚硫酸法測(cè)量

EPS該辦法較合適乳酸菌飲料EPS檢驗(yàn)，相對(duì)偏差為0.2%，具備不錯(cuò)的精確性。透析液經(jīng)稀釋液取2.0mL添加1.0mL6.0%的甲酸水溶液，5.0mL95.0%的硫酸，靜放10min，快速震蕩器上震蕩混勻，靜放20min至制冷。490nm測(cè)量OD值。標(biāo)曲上搜索相匹配糖成分，即得乳酸菌飲料胞外含糖量生產(chǎn)量。

（5）獲取提純生產(chǎn)流程

斜坡→MRS液體培養(yǎng)基活性2次（37℃，24h）→搖床擴(kuò)張塑造（37℃，150r/min，24h）→離心式除去菌體（5mL，10000×g，8min）→加上三氯乙酸50%（w/v）（12h）→500r/min拌和5min→離心式沉積除蛋白質(zhì)（4℃，18000×g，30min）→上清加酒精沉積含糖量（100%，3倍容積，4℃，解決12h）→離心式（12000×g，30min）→低溫干燥→沉積溫開水融解（稀釋液10倍）→分析MD34（4℃，解決12h）→甲酸-硫酸測(cè)定方法OD值→EPS純凈度評(píng)定

二、結(jié)果與剖析

1、苯酚硫酸法標(biāo)曲制作

用葡萄糖水做為規(guī)范物，制作標(biāo)曲。由圖1得知，糖濃度值在0～32mg/L時(shí)，糖濃度值和透光性呈線性相關(guān)。

2、除蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)提升

（1）除蛋白質(zhì)中三氯乙酸濃度值的提升

將發(fā)酵物根據(jù)離心式的辦法去除菌體后，各自添加30%、40%、50%的三氯乙酸水溶液1/5容積，討論不一樣三氯乙酸濃度值對(duì)蛋白沉積的危害，如圖所示2所顯示。三氯乙酸濃度值在30%～50%時(shí)與發(fā)酵物含糖量生產(chǎn)量呈正比例關(guān)聯(lián)，三氯乙酸濃度值過過高對(duì)含糖量的構(gòu)造造成危害，因而基本明確除蛋白質(zhì)環(huán)節(jié)三氯乙酸的最佳濃度值為50%。

（2）除蛋白質(zhì)中向心力提升

本實(shí)驗(yàn)操作中發(fā)酵物體細(xì)胞分離出來后，添加50%的三氯乙酸水溶液1/5容積，各自在10000×g、12000×g、13000×g、16000×g向心力下離心式30min，選擇最優(yōu)控制離心式標(biāo)準(zhǔn)，如圖所示3所顯示。在向心力16000×g時(shí)，含糖量得率超過最高值，選16000×g為最佳向心力。