枸杞子（wolfberry，RW）為茄科枸杞子屬綠色植物，是國(guó)內(nèi)傳統(tǒng)式名貴中藥，從古至今一直把它做為滋補(bǔ)養(yǎng)生佳品，關(guān)鍵包含靈芝多糖，胡羅卜素等各種活力成份?！侗静菥V目》中記述枸杞子“久服堅(jiān)骨筋，益身青春不老，耐暑寒”。枸杞子性甘辛平，現(xiàn)代科學(xué)研究表明，枸杞子具備滋養(yǎng)腎臟、益腎清目、防衰老等諸多作用。

變老是一種由各種要素造成的細(xì)微而又繁雜的生理現(xiàn)象，一般隨著著生理作用的衰退乃至衰退，根據(jù)變老的自由基學(xué)說，變老與人體細(xì)胞的空氣氧化損害緊密聯(lián)系。枸杞子做為自然的抗氧劑，其清除自由基和延緩衰老作用獲得了普遍的關(guān)心。近些年，枸杞子功能食品的分析和研發(fā)愈來愈深
入，尤其是枸杞子做為抗氧化食品的開發(fā)設(shè)計(jì)，已變成枸杞子制造業(yè)科學(xué)研究的網(wǎng)絡(luò)熱點(diǎn)。

美拉德反應(yīng)是一種在糧食加工環(huán)節(jié)中普遍出現(xiàn)的非酶褐變反映，關(guān)鍵就是指還原性糖與碳水化合物、蛋白相互之間的繁雜反映。美拉德反應(yīng)除開能改進(jìn)食品類感觀質(zhì)量，如顏色和口味外，研究表明，美拉德反應(yīng)物質(zhì)中的類黑精具備一定的抗氧化性特點(diǎn)，這為找尋和運(yùn)用純天然抗氧劑給予了新的構(gòu)思。

雖然枸杞子和美拉德反應(yīng)物質(zhì)均有清除自由基功效，且具有一定的理論基礎(chǔ)，但二者相結(jié)合后的物質(zhì)是不是會(huì)出現(xiàn)更強(qiáng)的實(shí)際效果，現(xiàn)階段仍末見報(bào)導(dǎo)。因此 ，本試驗(yàn)選用美拉德反應(yīng)基本原理，制取一種褐變野生黑枸杞新品，以黑腹家蠅為研究目標(biāo)，深層次研究褐變野生黑枸杞（brownblackwolfberry，BBW）的抗氧化性功效，進(jìn)而為美拉德反應(yīng)物質(zhì)在功能性食品行業(yè)的使用給予理論來源。

一、原材料與方式

1、原材料與儀器設(shè)備

枸杞子由甘肅早康高新科技有限責(zé)任公司給予，黑腹家蠅，由天津市科技學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)校食用添加劑與功能性調(diào)料試驗(yàn)室給予；玉米面粉、發(fā)酵粉，購(gòu)自天津?yàn)I海新區(qū)明耀商場(chǎng)；無水葡萄糖、瓊脂粉，購(gòu)于天津市春江化工廠有限責(zé)任公司；對(duì)甲基苯甲酸乙酯，購(gòu)于北京市鼎國(guó)興盛生物科技企業(yè)；沒食子酸、蘆丁、福林酚試劑，購(gòu)于北京索萊寶微生物有限責(zé)任公司；過氧化氫酶（CAT）檢測(cè)試劑盒、超氧化物歧化酶（SOD）檢測(cè)試劑盒（測(cè)分析）、考馬斯亮藍(lán)檢測(cè)試劑盒、丙二醛（MDA）檢測(cè)試劑盒，購(gòu)于南京建成生物技術(shù)研究室。

HWS-850智能化恒溫恒濕設(shè)備恒溫箱，寧波海曙賽福試驗(yàn)儀器廠；MultiskanFC酶標(biāo)儀，英國(guó)ThermoFisher企業(yè)；UVmini-1240紫外線/由此可見光度計(jì)，日本安捷倫儀器分析儀器公司；MyiQ2即時(shí)定量PCR儀，英國(guó)Bio-Rad公司；冷凍離心機(jī)，英國(guó)Thermo企業(yè)。

2、實(shí)驗(yàn)方法：

（1）褐變野生黑枸杞的制取

以寧夏枸杞為原材料，在75%空氣濕度和700C標(biāo)準(zhǔn)下置放6d，再在450C的風(fēng)機(jī)烘干箱中干躁定形。干躁風(fēng)力0.5m/s，干躁時(shí)間60min就可以。獲得的褐變野生黑枸杞在溫開水中泡浸、磨漿、離心式、取上清液，濃縮預(yù)留。

（2）褐變野生黑枸杞中黃酮類物質(zhì)、總酚和褐變指數(shù)值的測(cè)量

黃酮類類物質(zhì)的測(cè)量參考SZDB/Z349–2019《黃酮類化合物的測(cè)定》中紫外線分光儀深度廣度法；花青素的測(cè)量選用福林酚法；褐變指數(shù)值的測(cè)量參考Xia等的方式 ，從褐變野生黑枸杞和紅枸杞中獲取相對(duì)分子質(zhì)量（＞10kDa）的蛋白質(zhì)黑色素，在420nm處測(cè)定的OD值做為OD值。

（3）褐變野生黑枸杞中關(guān)鍵酚類物質(zhì)的測(cè)量

選用高效液相色譜色譜分析。檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)：離子交換柱：C18（250mm×4.6mm，5μm，）；流動(dòng)性相A：2%苯甲酸；流動(dòng)性相B：乙腈；柱溫35～40C；進(jìn)樣量20uL；流動(dòng)速度：0.8mL/min；檢驗(yàn)光波長(zhǎng)：280nm；探測(cè)器為SPD紫外線探測(cè)器，用前過0.45μm膜，減壓蒸餾，過柱程序流程如表1所顯示。

（4）家蠅的塑造

基本培養(yǎng)液：玉米面粉72g，無水葡萄糖72g，瓊脂粉6g，發(fā)酵粉10g，40mL添加劑（1%對(duì)甲基苯甲酸乙酯的75%乙醇溶液），750mL純凈水。給藥培養(yǎng)液：在基本培養(yǎng)液基本上各自依照終濃度值3mg/mL、12mg/mL加上相對(duì)應(yīng)使用量的褐變野生黑枸杞和紅枸杞。

（5）家蠅使用壽命試驗(yàn)

搜集2d齡的雄、雌蟲家蠅各1000只，均值分成5組，各自塑造在帶有0、3、12mg/mL褐變野生黑枸杞和紅枸杞的培養(yǎng)液內(nèi)，每一組10管，每管20只，給藥使用量的挑選參考劉亞荷等科學(xué)研究結(jié)果，在反復(fù)測(cè)試的根基上最后明確。在250⁰C、空氣濕度50%的恒溫恒濕設(shè)備恒溫箱中塑造。試驗(yàn)操作過程中，每3d拆換新的培養(yǎng)液，與此同時(shí)觀查家蠅存活，情況并紀(jì)錄，直到家蠅所有身亡，并反復(fù)試驗(yàn)。最終統(tǒng)計(jì)分析家蠅的人均壽命、過半數(shù)身亡使用壽命和最大使用壽命（每組最終20只身亡家蠅的日數(shù)平均值）。

（6）家蠅亞急性試驗(yàn)

搜集2d齡雄、雌蟲家蠅各1000只，每一組200只，選用高效液相色譜色譜分析。檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)：離子交換柱：C18（250mm×4.6mm，5μm）；流動(dòng)性相A：2%苯甲酸；流動(dòng)性相B：乙腈；柱溫35～40⁰C；進(jìn)樣量20uL；流動(dòng)速度：0.8mL/min；檢驗(yàn)光波長(zhǎng)：280nm；探測(cè)器為SPD紫外線探測(cè)器，用前過0.45μm膜，減壓蒸餾，塑造25d后，挨餓2h，CO2麻醉劑后導(dǎo)進(jìn)無培養(yǎng)液的整潔家蠅試管嬰兒中，將沾有含30%H2O2的6%葡萄糖水溶液的過濾紙條放進(jìn)試管嬰兒，確保過濾紙條所有侵潤(rùn)但不可能有液態(tài)流下來，每2h紀(jì)錄家蠅死亡率，直到家蠅所有身亡。

（7）家蠅抗抗霉素活測(cè)量

搜集2d齡的雌、男性家蠅各1000只，每一組200只，選用高效液相色譜色譜分析。檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)：離子交換柱：C18（250mm×4.6mm，5μm）；流動(dòng)性相A：2%苯甲酸；流動(dòng)性相B：乙腈；柱溫35～40⁰C；進(jìn)樣量20uL；流動(dòng)速度：0.8mL/min；檢驗(yàn)光波長(zhǎng)：280nm；探測(cè)器為SPD紫外線探測(cè)器，用前過0.45μm膜，減壓蒸餾，塑造45d后，禁2h，CO2麻醉劑后秤重，-800C預(yù)留。家蠅和鹽水1∶49（m/m）冰面勻漿，4⁰C，2500r/min離心式，搜集上清液測(cè)量蛋白質(zhì)濃度值，T-SOD、CAT魅力及MDA成分。