鯰魚（Silvercarp，Hypophthalmichthysmolitrix），脊索動物門、硬骨魚綱、鯉形目、鯉科、鰱屬，是廣為人知的四大家魚之一，生產量僅次鯉魚，2019年年銷售額381.0三萬t。鯰魚中包含充足的蛋白質食物和多種多樣不飽和脂肪，包含8種必須氨基酸和組氨酸，在其中二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸的成分做到海水魚規(guī)范；鯰魚中還包含鉀、鈉、鈣、鎂、磷等常量元素及其鋅、硒、鐵等營養(yǎng)元素。其肉薄刺多，腥味較重，銷售市場上主要是以活物的市場銷售為主導，一部分鯰魚被生產成冷凍品魚肉、飼料產品及蝦丸，利用率不高，還導致許多的廢棄物，污染環(huán)境，資源消耗比較嚴重，顧客接受度小于其他海產品。根據(jù)生產加工成魚漿產品，可增強其經濟價值。

魚漿產品在凍藏全過程中容易腐壞霉變。其腐壞體制涉及到微生物、有機化學、物理學等轉變 ，在其中，微生物菌種是造成腐壞的首要要素，尤其是新穎和冷凍產品，因為未經由高溫度解決或其他處理方法消毒殺菌，粘附在食物中的細菌生長繁育，最后造成食品類腐壞霉變。Lücking等對369種腐壞的食品類試品的研究發(fā)現(xiàn)，蠟樣芽胞鏈球菌和蕨類芽胞鏈球菌占主導性，還檢驗到極少數(shù)的海面芽胞八疊革蘭陰性桿菌，與此同時證實蕨類芽胞鏈球菌具備一定的蛋白質核糖核苷酸活力，可以溶解運用蛋白。本精英團隊過去的研究發(fā)現(xiàn)，蕨類枯草芽孢菌是導致鯰魚糜產品腐壞的優(yōu)點腐壞菌之一。1945年，法國Rose等在蕨類芽胞鏈球菌中發(fā)覺堿性蛋白酶，它是一類在偏堿情況下可以水解反應蛋白肽鍵的抗氧化物。趙巧靈運用差別蛋白組學技術性科學研究藍鰭金槍魚在冷凍歷程中的質量轉變，魚類機構胰蛋白酶加快肌原纖維構造蛋白溶解全過程，毀壞魚類組織架構，造成 魚類質量降低。

本實驗中，運用差別蛋白組學技術性科學研究蕨類芽胞鏈球菌堿性蛋白酶對鯰魚肌原纖維蛋白質的溶解功效，找尋溶解全過程中的肌原纖維蛋白質差別蛋白質點，并運用GO作用注解及KEEG通道剖析鯰魚肌原纖維蛋白質微生物菌種溶解的方式，為將來鯰魚等海產品的微生物菌種腐壞科學研究帶來理論來源。

1原材料與方式

1.1原材料與實驗試劑

活鯰魚購于遼寧營口市林南街水產市場，1h內運輸至試驗室，馬上涼水至死。固相pH值梯度方向（immobilizedpHgradient，IPG）預制構件干密封膠條（pH4～7，17cm）、媒介兩性關系電解質溶液（pH3～10、pH5～8、pH4～6和pH5～7）、Ｔrisbase、苯甲基磺酰氟（PMSF）、尿素溶液、硫脲、二硫蘇糖醇（DＴＴ）、碘乙酰胺、3-[3-（膽氟苯丙基）二甲羥基]丙磺酸內鹽（CHAPS）、聚合硫酸鐵凝膠電泳（PAGE）所需正丁酸、甲叉雙丙烯酰胺、十二甲基硝酸鈉（SDS）、礦物質機油、四羥基乙二胺（ＴEMED）、過硫酸銨、甘氨酸均選購自英國BioRad公司；凡士林、溴酚藍、瓊脂糖均為國內分析純，全部水溶液均以Milli-Q超純水系統(tǒng)制取的超純水系統(tǒng)為有機溶劑。

1.2儀器設備與機器設備

5800MALDI-ＴOF/ＴOF質譜儀器，ABSCIEX企業(yè)；UＶ-2550型紫外線由此可見光度計，日本安捷倫儀器企業(yè)；MILLI-QREFERENC超純水系統(tǒng)，英國密理博企業(yè)；GS-800-ＴM校準型光密度掃描機，英國Bio-Rad公司；DL-1005型超低溫冷凍液循環(huán)，上海市漢諾儀器設備有限責任公司；PROＴEANIEF等電對焦電泳儀，英國Bio-Rad公司；PROＴEAN83ⅡXL電泳槽，英國Bio-Rad公司；ZD-9556型水準脫色搖床，常州市凱航儀器設備有限責任公司；FE20pH計，梅特勒-托利多儀器設備有限責任公司；SORＶALLStratos冷藏離心機，英國Ｔhermo企業(yè)。

1.3實驗方式

1.3.1原材料預備處理

1.3.1.1鯰魚肌原纖維蛋白質獲取

參照李學鵬等的方式 ，取魚類20g并攪碎。添加5倍容積10mmol/L的Ｔris-HCl（pH7.2），快速勻質2min，每過30s，停30s。在5000r/min、4℃標準下離心式15min。取沉積，在沉積中添加3倍大小的ＴrisHCl（含0.6mol/LNaCl，10mmol/LＴris，pH7.2）緩沖溶液，快速勻質，后在4500r/min、4℃標準下離心式15min，雙縮脲測定方法其濃度值。取上清液儲藏在-80℃冰柜中預留。

1.3.1.2堿性蛋白酶解決

將干酶粉稀釋液至0.01g/mL，并取20mL肌原纖維蛋白質水溶液，加上等同于蛋白品質0.1%的偏堿胰蛋白酶酶液，放置磁力攪拌器上，各自在4℃和25℃下反映。堿性蛋白酶解決時間各自為：4℃選擇0，1，2h；25℃選擇0，0.5，1h。反映完成后馬上添加適量50mmol/LPMSF抑止酶活。

1.3.2雙向電泳

1.3.2.1等電對焦程序流程

參照Bio-Rad公司雙向電泳實際操作技術性指南及本精英團隊早期已探究出鯰魚肌原纖維蛋白質的雙重凝膠電泳技術性（twodimensionalgelelectrophoresis，2-DE）開展實驗。將少量的已定量分析蛋白水溶液與凝固上樣緩沖溶液（含7mol/L尿素溶液、2mol/L硫脲、4%CHAPS、65mmol/LDＴＴ、0.2%媒介兩性關系電解質溶液和0.001%溴酚藍）充足混和，選用17cm，pH4～7的IPG預制構件干密封膠條開展等電對焦，100μg，300μL積極凝固上樣，著色方法為硝酸銀上色。等電對焦程序流程基本參數(shù)如表1所顯示。

1.3.2.2密封膠條均衡

等電對焦完畢后，每根密封膠條用6mL密封膠條均衡緩沖溶液Ⅰ〔6mol/L尿素溶液、2%SDS、0.375mol/LＴris-HCl（pH8.8）、20%凡士林和2%DＴＴ〕緩和中液Ⅱ[6mol/L尿素溶液、2%SDS、0.375mol/LＴris-HCl（pH8.8）、20%凡士林和2.5%碘乙酰胺]開展密封膠條均衡，每一次14min。

1.3.2.3第二向SDS-PAGE豎直凝膠電泳

將均衡結束的密封膠條于1×電級緩沖溶液（含3g/LＴrisbase、14.4g/L甘氨酸、1g/LSDS）中洗掉不必要平衡液，各自遷移至提早制完的第二向10%，12%，15%聚正丁酸分離出來膠上方，并添加低溶點瓊脂糖上膠液（0.5%低溶點瓊脂粉、25mmol/LＴris-base、192mmol/L甘氨酸、0.1%SDS和0.001%溴酚藍），清除汽泡，待其完全凝結后，遷移至垂直電泳槽中，恒流源開展第二向SDS-PAGE，程序流程見表2。

1.3.2.4銀染、凝膠成像及剖析

選用論文參考文獻的辦法并略微改動。將銀染后的疑膠轉到GS-800疑膠掃描儀成像儀投影服務平臺上。

選用PDQuest8.0二維疑膠圖象技術專業(yè)分析系統(tǒng)對所述圖象開展環(huán)境削減、蛋白質點檢驗和配對等解決，找尋差別蛋白質點。

1.3.3差別蛋白質點的質譜分析評定

1.3.3.1酶解

參照Addis等和Bernevic等的方式 ，從銀染的疑膠上獲得蛋白點，放進硅化解決過的1.5mL少量離心管架中，用超純水系統(tǒng)不斷浸洗后，對該蛋白質點開展膠內酶切。

1）褪色

在掛有蛋白質點的移液管中，添加50μL褪色液[15mmol/LK3Fe（CN）6溶解50mmol/LNa2S2O3中]，將蛋白質點的深棕色褪色至淺綠色，用超純水系統(tǒng)浸洗以停止反映，直到蛋白質點變成沒有顏色全透明。隨后將蛋白質點所依附的正丁酸剁碎，用100mmol/LNH4HCO3浸洗，并且用100%乙腈（色譜純）褪色至正丁酸疑膠色調泛白，接著將其放置冷藏真空干燥器中開展干凍。

2）酶解

用pH8.0的蛋白酶液（以50mmol/L硝酸鉀水溶液為有機溶劑）將干凍的試品于37℃酶解留宿。每一個蛋白質點蛋白酶使用量依據(jù)蛋白質點尺寸，每一個蛋白質點約40～100ng蛋白酶。

3）提純

酶解后的肽段用60μL5%ＴFA和50%乙腈開展提純，反復2次，每一次15min，合拼提取液并真空泵排干。

4）試品復溶與除鹽

選用0.1%ＴFA水溶液將干躁后的試樣再度復溶，并且用ZipＴIP移液嘴除鹽。將1μL除鹽后的試品放置質譜分析試品板上實現(xiàn)當然干躁，開展MALDI-ＴOF/ＴOF剖析，檢驗標準見表3。