大黑豆因其種皮呈灰黑色而而出名，營養(yǎng)豐富，具備高蛋白食物、低脂肪的特點(diǎn)，其富含營養(yǎng)元素、維他命和黃豆皂角苷等各種作用因素，除此之外，大黑豆還具備美容護(hù)膚、抗癌功效；幾丁聚糖是一種玻璃化溫度在2～20中間的低聚糖，具備相對(duì)分子質(zhì)量低、吸咐效果非常的好，水溶好、易被身體消化吸收、生物活性高，調(diào)整腸道微生態(tài)、改進(jìn)腸胃機(jī)構(gòu)特征和增強(qiáng)免疫作用等特性；蛋白的糖基化裝飾，是以化學(xué)鍵聯(lián)接的形式將吸水性的糖原化學(xué)物質(zhì)導(dǎo)進(jìn)蛋白質(zhì)分子當(dāng)中，使其不僅有蛋白的分子結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，又有糖原成分的親水性特點(diǎn)；研究表明，蛋白糖基化裝飾后呈現(xiàn)出優(yōu)異的乳狀液工作能力，其溶解度、膠凝性、流變學(xué)特點(diǎn)、抗氧化、耐熱性、抑菌性等功能性性能也逐步提高。蛋白糖基化裝飾后抗氧化的分析較少；文中運(yùn)用糖基化裝飾技術(shù)性，以幾丁聚糖和大黑豆蛋白質(zhì)為研究對(duì)象，制取幾丁聚糖糖基化大黑豆蛋白質(zhì)，討論其耐熱性能的轉(zhuǎn)變，為擴(kuò)展糖基化蛋白質(zhì)改性材料和給予純天然的抗氧劑給予基本上技術(shù)性根據(jù)。

一、原材料與方式

1、原材料和實(shí)驗(yàn)試劑

大黑豆，黑龍江省房地產(chǎn)青仁黑豆。DPPH(分析純)，英國Sigam企業(yè)；ABTS(AR級(jí))，英國Sigam企業(yè)；水溶維生素E(Trolox)，英國Sigam企業(yè)；幾丁聚糖，浙江省金殼醫(yī)藥有限責(zé)任公司；三氯化鐵(FeCl₃)(分析純)，天津市金匯太亞化學(xué)藥品有限責(zé)任公司；鐵氰化鉀(K₃Fe(CN)₄)(分析純)，天津市收復(fù)生物化工研究所；三氯乙酸(分析純)，天津大茂化學(xué)藥品廠，磷酸三鈉(Na₃PO₄)(分析純)，天津長鑫宏翔經(jīng)貿(mào)有限責(zé)任公司；鉬酸銨(分析純)，天津科密歐化學(xué)藥品有限責(zé)任公司；亞硝酸鈉(分析純)，天津鴻鑫化學(xué)藥品有限責(zé)任公司；對(duì)羥基苯磺氟苯(分析純)，天津市收復(fù)生物化工研究所；硫酸N-(1-萘基)-乙二胺(分析純)，天津市收復(fù)生物化工研究所。

2、實(shí)驗(yàn)儀器

DK-98-ⅡA電加熱恒溫水浴鍋購白天津泰斯特儀器設(shè)備有限責(zé)任公司；紫外線由此可見光度計(jì)購自瓦里安高新科技有限責(zé)任公司；XS204電子器件電子分析天平購自上海市精學(xué)科學(xué)研究有限責(zé)任公司；漩渦混合器購自江蘇省同君儀器設(shè)備高新科技有限責(zé)任公司。

3、方式

（1）水溶液配置

①DPPH切削液配備：精準(zhǔn)稱重0.0123gDPPH，酒精充足融解并滴定劑至50mL，做為DPPH切削液(0.39mM)。

②PBS緩沖溶液：稱量8gNaCl、0.2gKCl、1.44gNa₂HP0₄和0.24gKH₂P0₄，溶解800mL純凈水中，用HCl調(diào)整溶劑的pH至7.4，最終加蒸溜水滴定劑至lL就可以。髙壓蒸氣殺菌20min，儲(chǔ)存于室內(nèi)溫度或4℃冰柜中。

③ABTS切削液配備：精準(zhǔn)稱量0.192lgABTS標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)融解于50mL純凈水中，做成7.0mol／L的ABTS溶液。精準(zhǔn)稱量0.3312g過硫酸鉀融解于500mL純凈水中，做成2.45mmo/L過硫酸鉀溶液。將50mLABTS溶液與50mL過硫酸鉀溶液混和，在常溫下遮光置放12h～16h，產(chǎn)生ABTS氧自由基貯備液。精確汲取1.0mL添加40～50mL的工業(yè)乙醇，在734nm下OD值為O.700±0.020獲得ABTS切削液。

(2)大黑豆蛋白質(zhì)的制取

①大黑豆分離蛋白：大黑豆蛋白質(zhì)分離出來獲取的方式參考本科學(xué)研究早期實(shí)驗(yàn)中歷經(jīng)調(diào)優(yōu)的獲取計(jì)劃方案：400g大黑豆豆柏粉，放水4L，用0.5mol／LNaoH調(diào)pH至8.5，50℃水浴拌和1.5h，8000r/min離心式10min取上清液，用0.5mol／L硫酸調(diào)pH至4.5，8000r/min離心式10min取下一層固態(tài)，用pH為4.5的純凈水洗二遍，8000r/min離心式10min，取沉積，用0.5mol／LNaOH調(diào)pH至7.0，低溫干燥(干躁標(biāo)準(zhǔn)：干躁架溫度-20℃，真空值0.5mbar)

②酶法糖基化大黑豆蛋白質(zhì)：酶法糖基化大黑豆蛋白質(zhì)的方式參考本試驗(yàn)早期實(shí)驗(yàn)中提升所得的計(jì)劃方案：取1.5g大黑豆分離蛋白，加1.5g幾丁聚糖，1.0g轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶和100mL純凈水，37℃水準(zhǔn)震蕩反映4h，80℃水浴滅酶5min，制冷至常溫后4℃分析去除未融合的幾丁聚糖，低溫干燥。

③自化學(xué)交聯(lián)大黑豆蛋白質(zhì)：為比照不一樣改性材料方式下大黑豆蛋白質(zhì)的抗氧化，轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的添加占比同②，取1.5g大黑豆分離蛋白，加1.0g轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶和100mL純凈水，37℃水準(zhǔn)震蕩反映4h，80℃水浴滅酶5min，制冷至常溫后4℃分析去除未融合的幾丁聚糖，低溫干燥。

④寒濕法糖基化大黑豆蛋白質(zhì)：為比照不一樣改性材料方式下大黑豆蛋白質(zhì)的抗氧化，幾丁聚糖的添加占比同②，取1.5g大黑豆分離蛋白，加1.5g幾丁聚糖和100mL純凈水，90℃水浴4h，取下在25℃水浴5min，4℃分析去除未融合的幾丁聚糖，低溫干燥。

(3)DPPH氧自由基消除工作能力測(cè)量

本實(shí)驗(yàn)中DPPH氧自由基消除工作能力測(cè)量在參照Sajga等的辦法基本上，稍加修改。汲取1mL待測(cè)液，添加2mLDPPH切削液充足混勻，在常溫下遮光30min，在517m處測(cè)量該液OD值(Ai)，以工業(yè)乙醇做為空缺，與此同時(shí)測(cè)量lmL標(biāo)準(zhǔn)溶液與2mL工業(yè)乙醇的OD值(Aj)及1mL工業(yè)乙醇和2mLDPPH切削液溶液的OD值(Ac)，按住式測(cè)算DPPH的清除率(SA)。

（4）ABTS隨意消除工作能力測(cè)量

參考唐艷公平的方式稍作修改。汲取1.0mL待測(cè)液添加1.0mL的ABTS切削液，攪拌。在常溫下遮光10min，于光波長734nm下測(cè)其OD值(Ai)，工業(yè)乙醇做為空缺，與此同時(shí)測(cè)量30μL標(biāo)準(zhǔn)溶液和1.0mL工業(yè)乙醇溶液OD值(Aj)及30μL工業(yè)乙醇和1.0mL的ABTS切削液溶液OD值(Ac)，按住式測(cè)算ABTS氧自由基清除率(SA)。

（5）總復(fù)原功能的測(cè)量

本實(shí)驗(yàn)中試品總復(fù)原功能的檢測(cè)在Oyaizu等的辦法基本上稍加調(diào)節(jié)。取檢測(cè)試樣水溶液0.5mL添加pH為6.6的聚磷酸鹽緩沖液和1％的K₃Fe(CN)₆水溶液各2.5mL并攪拌勻稱，于50℃置放20min，添加2.5mL純凈水和1.0mL0.1％的FeCl₃混和勻稱，靜止不動(dòng)10min后于700nm下測(cè)量OD值(用0.5mL的純凈水更換0.5mL試品水溶液別的標(biāo)準(zhǔn)不會(huì)改變做為調(diào)零水溶液)。

（6）總抗氧化能力的測(cè)量

本實(shí)驗(yàn)中總抗氧化能力的測(cè)量參考Benzuie和Strain的方式 ，略做改善。應(yīng)用磷鉬絡(luò)離子法，又被稱為鉬藍(lán)法?？偪寡趸芰y(cè)量基本原理：鉬酸銨會(huì)在鹽酸與硫酸銨的效果下產(chǎn)生氧化反應(yīng)，物質(zhì)展現(xiàn)翠綠色，該成分在695nm上有較大消化吸收光波長?？寡鮿?huì)和鉬會(huì)市場(chǎng)競(jìng)爭產(chǎn)生氧化反應(yīng)，進(jìn)而危害翠綠色物質(zhì)的產(chǎn)生量。能夠根據(jù)光度法根據(jù)測(cè)量OD值來檢驗(yàn)鉬藍(lán)的生產(chǎn)量，為此間接性的體現(xiàn)出抗氧劑的工作能力。OD值值越高說明抗氧劑的抗氧化能力越強(qiáng)。在具塞試管嬰兒中先后添加1.0mL(3mol／L)H₂S0₄水溶液，1.0mL(0.14mol／L)Na₃P0₄水溶液和1.0mL(0.2mol／L)鉬酸銨水溶液，再各自添加1.0mol之上試品水溶液，純凈水滴定劑至5.0mL混勻，變道于95℃溶液中加溫90min，取下散熱至室內(nèi)溫度后在695nm光波長下測(cè)量OD值。

（7）消除亞磷酸鹽工作能力的測(cè)量

本實(shí)驗(yàn)中亞硝酸鈉消除工作能力的測(cè)量依據(jù)李佳穎等的方式 ，稍作改動(dòng)。精確汲取0.5mL試品水溶液于試管嬰兒中，各自添加5μg，mL亞硝酸鈉水溶液250μL，震蕩勻稱，加pH3.0的檸檬酸鈉-磷酸二氫鈉緩沖溶液2.0mL，攪拌后于37℃水浴30min。添加1mL濃度值為0.4％對(duì)羥基苯磺氟苯和1mL濃度值為0.2％硫酸N-(1-萘基)-乙二胺，攪拌并滴定劑至標(biāo)尺，靜放15min，于545nm光波長測(cè)量其OD值A(chǔ)o。同用工業(yè)乙醇替代試品別的標(biāo)準(zhǔn)不會(huì)改變，測(cè)得吸光度數(shù)值氏；lmL濃度值為0.2％硫酸N-(1-萘基)-乙二胺替換成1.0mL工業(yè)乙醇測(cè)量吸光度數(shù)值A(chǔ)₂。按住式測(cè)算清除率(SA)。