乳酸菌飲料是一類(lèi)可發(fā)醇運(yùn)用糖類(lèi)與碳水化合物并產(chǎn)乳酸菌的革蘭氏陽(yáng)性菌的統(tǒng)稱(chēng)。具備調(diào)整腸胃內(nèi)有益菌構(gòu)造、改進(jìn)腸胃微自然環(huán)境，減少血清蛋白碳水化合物等生理作用。乳酸菌飲料還做為一種主要的工業(yè)生產(chǎn)微生物菌種，廣泛運(yùn)用于制做生抽、熏腸、酸菜等食品類(lèi)發(fā)醇領(lǐng)域。

現(xiàn)階段醫(yī)療設(shè)備上抗菌素的亂用產(chǎn)生了嚴(yán)重威脅，很多耐藥性基因突變菌種的發(fā)生讓大家無(wú)計(jì)可施，急待發(fā)覺(jué)一類(lèi)新式翠綠色抑菌化學(xué)物質(zhì)來(lái)替代抗菌素，病菌素被覺(jué)得是當(dāng)前最好的抗菌素代替品。病菌素是由乳酸菌飲料造成的具備抗菌活力的肽類(lèi)或蛋白質(zhì)類(lèi)化合物，普遍出現(xiàn)于乳酸菌飲料新陳代謝物質(zhì)中。做為一種蛋白質(zhì)類(lèi)化合物，病菌素可被胰蛋白酶水解反應(yīng)而不容易殘余于人或動(dòng)植物身體，不容易造成抗藥性，因而具備較高的安全系數(shù)。病菌素還能抑制片革蘭陰性桿菌、李斯特菌、梭菌、橙黃色鏈球菌等腐壞菌的生長(zhǎng)發(fā)育，被認(rèn)可為食品保藏技術(shù)性中最具備開(kāi)發(fā)設(shè)計(jì)和應(yīng)用前景的化學(xué)物質(zhì)。

近些年，產(chǎn)病菌素乳酸菌飲料的挑選與評(píng)定在全國(guó)各地多種多樣酸菜科學(xué)研究中多有報(bào)導(dǎo)。但在河南當(dāng)?shù)厮岵酥袇s末見(jiàn)報(bào)導(dǎo)。文中從安徽省當(dāng)?shù)厮岵酥刑暨x對(duì)大腸埃希菌和金黃鏈球菌有抑制效果的乳酸菌飲料菌種，獲得菌種L.plantarumPC-3，對(duì)其開(kāi)展生理學(xué)生物化學(xué)和生物學(xué)試驗(yàn)評(píng)定，并明確其所產(chǎn)關(guān)鍵抗菌物質(zhì)的性質(zhì)，為開(kāi)發(fā)設(shè)計(jì)食品類(lèi)運(yùn)送和貯存歷程中操縱有危害菌的拮抗作用中藥制劑考慮菌種和具備新式微生物添加劑作用的病菌素造成菌給予了理論來(lái)源。

一、原材料與方式

1、原材料與實(shí)驗(yàn)試劑

酸菜：安徽省家中自做，源自安徽省當(dāng)?shù)匦迈r介菜2500g，清洗，當(dāng)然晾曬，放進(jìn)清洗曬干的廣口泡菜壇底端，添加500g食用鹽，擦抹勻稱(chēng)，再向泡菜壇中添加冷水至壇口處，留意不必淹沒(méi)壇口，蓋緊壇蓋，在壇口邊緣處添加少量冷水密封性。置蔭涼干躁處，三個(gè)月后就能服用。標(biāo)示菌種：大腸埃希菌(ATCC8099)，橙黃色鏈球菌(ATCC6538)，購(gòu)自安徽省艾浮地艾空氣過(guò)濾檢驗(yàn)站，來(lái)自我國(guó)一般微生物菌種菌種保藏管理處。

MRS瓊脂粉培養(yǎng)液、MRS液體培養(yǎng)基、LB液體培養(yǎng)基：青島市新科技工業(yè)園區(qū)海博生物技術(shù)性有限責(zé)任公司；明膠液化培養(yǎng)液、磷酸鹽復(fù)原試驗(yàn)培養(yǎng)液：廣東環(huán)凱微生物菌種高新科技有限責(zé)任公司；精氨酸產(chǎn)氨試驗(yàn)對(duì)比生物化學(xué)管、SIM培養(yǎng)液、糖發(fā)醇生物化學(xué)管：青島市新科技工業(yè)園區(qū)海博生物技術(shù)性有限責(zé)任公司；瓊脂粉：索萊寶生物技術(shù)有限責(zé)任公司；過(guò)氧化氫酶(2500U／mg)、蛋白酶(250U／mg)、胃蛋白酶(3000U／mg)：上海市藍(lán)季生物技術(shù)有限責(zé)任公司；胰蛋白酶K(33.5U／mg)：德國(guó)默克MERCK；病菌基因DNA獲取檢測(cè)試劑盒、瓊脂糖電泳DNA回收利用檢測(cè)試劑盒、DL2000DNAMarker：天根生化高新科技有限責(zé)任公司；化學(xué)藥品均為分析純。

2、儀器設(shè)備與機(jī)器設(shè)備

梯度方向PCR儀：英國(guó)ABI企業(yè)，核苷酸電泳儀：北京六一儀器廠；AlphaImagerHP瑩光／能見(jiàn)光凝膠成像數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)：英國(guó)Alpha企業(yè)；S201-KpH計(jì)：梅特勒企業(yè)；SW-CJ-lF單人兩面超凈工作臺(tái)：蘇州凈化機(jī)械廠；生物顯微鏡：上海一恒高新科技有限責(zé)任公司；SHP-100生化培養(yǎng)箱：揚(yáng)中市三發(fā)電子器件有限責(zé)任公司；LS-B50L電加熱器式滅菌設(shè)備：江陰市各地診療機(jī)械廠；GL-16G-11快速冷凍離心機(jī)：上海安亭科學(xué)研究?jī)x器廠。

3、方式

（1）乳酸菌飲料的分離出來(lái)

無(wú)菌檢測(cè)情況下將酸菜與液汁混和勻稱(chēng)，取1mL液汁加至9mL殺菌鹽水中，做成1:10的試品勻液，充足震蕩后按以上實(shí)際操作次序，做10倍增長(zhǎng)稀釋液試品勻液，挑選2～3個(gè)持續(xù)的適合稀釋液度，每一個(gè)稀釋液度汲取0.1mL試品勻液各自施膠于含1％CaC03的MRS固體培養(yǎng)基上，37℃厭氧發(fā)酵塑造48h；挑菌有溶鈣圈的乳白色單菌體，在MRS固態(tài)平板電腦上劃線挑選，選擇單一菌體，進(jìn)一步畫(huà)線分離純化，挑菌單一菌體注射至MRS斜坡上，搞好標(biāo)識(shí)，4℃儲(chǔ)存預(yù)留。

(2)抗菌試驗(yàn)

①乳酸菌飲料無(wú)體細(xì)胞發(fā)醇上清液(cell-freefermentationsupematant，CFS)的制取2％接種量注射生長(zhǎng)發(fā)育至對(duì)數(shù)期的菌液于MRS液體培養(yǎng)基中，37℃厭氧發(fā)酵塑造48h，4℃、8000r／min離心式10min，搜集發(fā)醇上清液，0.45μL濾紙過(guò)慮，4℃儲(chǔ)存預(yù)留。

②牛津杯法抗菌試驗(yàn)

選用兩層瓊脂粉蔓延法，將10mL殺菌素瓊脂粉固體培養(yǎng)基倒進(jìn)無(wú)菌檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)皿中，待徹底凝結(jié)后做為最底層培養(yǎng)液，每皿按方形四角部位輕放進(jìn)4個(gè)無(wú)菌檢測(cè)牛津杯，將0.1mL濃度值為l×108CFU／mL的標(biāo)示菌液加至10mL制冷至45～50℃的LB固體培養(yǎng)基中，當(dāng)心攪拌后倒至最底層培養(yǎng)液上，留意不能加到牛津杯里，待其徹底凝結(jié)，做為菌層培養(yǎng)液。當(dāng)心取下牛津杯，留意不能影響已產(chǎn)生的孔眼，向直徑大約為8mm孔眼內(nèi)添加待檢CFS，37℃厭氧發(fā)酵塑造18h后，精確測(cè)量抑菌圈直徑。選用大腸埃希菌和金黃鏈球菌做為指示菌，與此同時(shí)用鹽水做為對(duì)比。選擇抑菌圈較大的乳酸菌飲料菌種作事后科學(xué)研究。

③乳酸菌飲料的產(chǎn)酸曲線圖與生長(zhǎng)曲線圖的測(cè)量

選用兩層瓊脂粉蔓延法，將10mL殺菌素瓊脂粉固體培養(yǎng)基倒進(jìn)無(wú)菌檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)皿中，待徹底凝結(jié)后做為最底層培養(yǎng)液，每皿按方形四角部位輕放進(jìn)4個(gè)無(wú)菌檢測(cè)牛津杯，將0.1mL濃度值為l×108CFU／mL的標(biāo)示菌液加至10mL制冷至45～50℃的LB固體培養(yǎng)基中，當(dāng)心攪拌后倒至最底層培養(yǎng)液上，留意不能加到牛津杯里，待其徹底凝結(jié)，做為菌層培養(yǎng)液。當(dāng)心取下牛津杯，留意不能影響已產(chǎn)生的孔眼，向直徑大約為8mm孔眼內(nèi)添加待檢CFS，37℃厭氧發(fā)酵塑造18h后，精確測(cè)量抑菌圈直徑。選用大腸埃希菌和金黃鏈球菌做為指示菌，與此同時(shí)用鹽水做為對(duì)比。選擇抑菌圈較大的乳酸菌飲料菌種作事后科學(xué)研究?？咕囼?yàn)中抑菌圈直徑較大的乳酸菌飲料單菌體，連接MRS液體培養(yǎng)基中，37℃厭氧發(fā)酵塑造48h，以2％接種量將種籽液接站MRS液體培養(yǎng)基中開(kāi)展繁衍塑造，各自在0、2、4、6，8，10，12、14716，18720，22，24，26，28、30、32、34、36、38、40、42、44、48h時(shí)抽樣，于光波長(zhǎng)600am處測(cè)量OD600和培養(yǎng)液的pH，以塑造時(shí)間為橫坐標(biāo)軸，以pH和OD600數(shù)值縱軸，制作塑造時(shí)間一光密度、pH標(biāo)曲。

（4）有機(jī)物、雙氧水殺菌作用清除試驗(yàn)

選用兩層瓊脂粉蔓延法，將10mL殺菌素瓊脂粉固體培養(yǎng)基倒進(jìn)無(wú)菌檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)皿中，待徹底凝結(jié)后做為最底層培養(yǎng)液，每皿按方形四角部位輕放進(jìn)4個(gè)無(wú)菌檢測(cè)牛津杯，將0.1mL濃度值為l×108CFU／mL的標(biāo)示菌液加至10mL制冷至45～50℃的LB固體培養(yǎng)基中，當(dāng)心攪拌后倒至最底層培養(yǎng)液上，留意不能加到牛津杯里，待其徹底凝結(jié)，做為菌層培養(yǎng)液。當(dāng)心取下牛津杯，留意不能影響已產(chǎn)生的孔眼，向直徑大約為8mm孔眼內(nèi)添加待檢CFS，37℃厭氧發(fā)酵塑造18h后，精確測(cè)量抑菌圈直徑。選用大腸埃希菌和金黃鏈球菌做為指示菌，與此同時(shí)用鹽水做為對(duì)比。選擇抑菌圈較大的乳酸菌飲料菌種作事后科學(xué)研究?？咕囼?yàn)中抑菌圈較大的乳酸菌飲料菌種CFS，將CFS的pH中合至5.0后，按選用兩層瓊脂粉蔓延法，將10mL殺菌素瓊脂粉固體培養(yǎng)基倒進(jìn)無(wú)菌檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)皿中，待徹底凝結(jié)后做為最底層培養(yǎng)液，每皿按方形四角部位輕放進(jìn)4個(gè)無(wú)菌檢測(cè)牛津杯，將0.1mL濃度值為l×108CFU／mL的標(biāo)示菌液加至10mL制冷至45～50℃的LB固體培養(yǎng)基中，當(dāng)心攪拌后倒至最底層培養(yǎng)液上，留意不能加到牛津杯里，待其徹底凝結(jié)，做為菌層培養(yǎng)液。當(dāng)心取下牛津杯，留意不能影響已產(chǎn)生的孔眼，向直徑大約為8mm孔眼內(nèi)添加待檢CFS，37℃厭氧發(fā)酵塑造18h后，精確測(cè)量抑菌圈直徑。選用大腸埃希菌和金黃鏈球菌做為指示菌，與此同時(shí)用鹽水做為對(duì)比。選擇抑菌圈較大的乳酸菌飲料菌種作事后科學(xué)研究流程做抗菌試驗(yàn)，并設(shè)pH=5.0的甲酸、乳酸菌和初始未調(diào)pH的CFS為對(duì)比，反復(fù)3次，精確測(cè)量抑菌圈直徑。取過(guò)氧化氫酶水溶液0.1mL，加至0.9mLpH=5.0的CFS中，使過(guò)氧化氫酶終濃度值為50U／mL，并設(shè)沒(méi)加過(guò)氧化氫酶的pH=5.0CFS和初始未調(diào)pH的CFS為對(duì)比，反復(fù)3次，牛津杯法精確測(cè)量其抑菌圈直徑。認(rèn)證乳酸菌飲料CFS的關(guān)鍵抗菌活性物質(zhì)是不是為有機(jī)物和雙氧水。